本發(fā)明屬于分子生物學(xué)，具體涉及一種耐有機(jī)溶劑的高活性rna切割型脫氧核酶(rna-cleaving?dnazyme)的發(fā)明及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、脫氧核酶(dnazyme)是一類人工合成的具有催化功能的核酸分子主要通過(guò)體外篩選(in?vitro?selection)或定向進(jìn)化(directed?evolution)技術(shù)從隨機(jī)dna文庫(kù)中分離獲得。最早的dnazyme是以pb2+離子為輔助因子從隨機(jī)dna文庫(kù)篩選獲得，在pb2+存在下催化酯交換反應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)的dnazyme可以催化包括dna或rna的切割、磷酸化或烷基化等多種反應(yīng)類型。相比于蛋白酶而言，dnazyme具有分子量小，可化學(xué)合成且穩(wěn)定性高，免疫原性低，可在目標(biāo)物(如金屬離子、小分子或大分子等)刺激下發(fā)生催化反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)等優(yōu)勢(shì)，因此在生物傳感、生物治療、邏輯運(yùn)算以及分子器件等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。其中，以具有rna切割活性的dnazyme最引人關(guān)注，目前基于dnazyme的重金屬離子便攜式探測(cè)器已成功商業(yè)化。

2、rna切割型dnazyme由底物鏈和酶鏈組成。底物鏈除了為完整的rna序列外，目前還常用單個(gè)rna堿基嵌入到dna序列作為底物來(lái)篩選dnazyme，其切割位點(diǎn)通常為rna與dna連接的磷酸二酯鍵。酶鏈為dna序列，一般包含催化區(qū)域和底物結(jié)合臂區(qū)域。dnazyme可通過(guò)順式或反式兩種模式催化底物切割，前者為dnazyme和底物連接成一個(gè)分子，后者為dnazyme和底物分別作為兩個(gè)獨(dú)立的分子。目前大多數(shù)公開(kāi)報(bào)道的dnazyme在正常生理狀態(tài)或接近正常生理狀態(tài)條件下發(fā)揮作用，限制了其在非正常條件下的應(yīng)用，例如在有機(jī)溶劑-水的混合溶劑體系(該條件在難溶于水的分子檢測(cè)領(lǐng)域具有重要意義)。此外，國(guó)際上公開(kāi)報(bào)道的催化反應(yīng)速度最快的rna切割型dnazyme是1997年joyce課題組篩選到的10-23，在水溶液中的催化轉(zhuǎn)換常數(shù)kcat最高為10min-1，迄今為止，尚未有突破該反應(yīng)速度的新dnazyme。因此，需要開(kāi)發(fā)能應(yīng)用于多種非正常條件以及催化速度更高的dnazyme，來(lái)拓展其應(yīng)用范圍，提高其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種獲得高活性rna切割型dnazyme的篩選文庫(kù)設(shè)計(jì)策略、耐有機(jī)溶劑的高活性的rna切割型dnazyme及其潛在應(yīng)用，以解決或改善現(xiàn)有技術(shù)中的dnazyme活性不高、難以在含有機(jī)溶劑條件下應(yīng)用等問(wèn)題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供耐有機(jī)溶劑的rna切割型dnazyme篩選或設(shè)計(jì)文庫(kù)，所述文庫(kù)基于dnazyme?e3p(5’-aagtggtgcccggaaagggtgactc?a-底物識(shí)別區(qū)-3’)構(gòu)建，包括：在e3p的3’和5’端分別引入若干個(gè)堿基作為pc?r引物識(shí)別區(qū)、在可變區(qū)域引入隨機(jī)序列，其中e3p的可變區(qū)域是指e3的5’端起第20-26個(gè)堿基。

4、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述隨機(jī)序列的長(zhǎng)度為10-60個(gè)堿基，優(yōu)選20-50個(gè)堿基，再優(yōu)選30-50個(gè)堿基，最優(yōu)選40個(gè)堿基。

5、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述引物識(shí)別區(qū)的長(zhǎng)度分別為16-19個(gè)堿基。

6、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，5’端引入atacag，3’端引入gtccga，與e3原有的一部分序列一起作為引物識(shí)別區(qū)域。

7、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，5’端pcr引物為：5’-atacagaagtggtg?ccc-3’；3’端pcr引物為：5’tcggacctatgaactgatg-3’。

8、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述引入是指隨機(jī)序列插入可變區(qū)，或替代可變區(qū)的部分或全部堿基。

9、優(yōu)選地，底物識(shí)別區(qū)為大于10nt的任意dna序列；優(yōu)選為5’-tcagttca?tag-3’。

10、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述dnazyme篩選或設(shè)計(jì)文庫(kù)包括如下序列的核酸分子：5’-atacagaagtggtgcccggaaagggtg-n40-actcatcag?ttcataggtccga-3’，其中n40是40個(gè)隨機(jī)堿基。

11、本發(fā)明第二方面提供耐有機(jī)溶劑的切割rna的dnazyme，所述dnazyme包括如下結(jié)構(gòu)：從5’到3’依次包含6nt的5’部分引物識(shí)別區(qū)，e3p的1-19位的莖環(huán)區(qū)，e3p的20-26位的可變區(qū)，以及任選位于e3p可變區(qū)的定向進(jìn)化區(qū)(通過(guò)體外篩選從隨機(jī)文庫(kù)中獲得的序列)，底物識(shí)別區(qū)，任選的3’部分引物識(shí)別區(qū)；

12、其中所述酶的的3’端還可以任選地包含1-6個(gè)，優(yōu)選1-3個(gè)堿基的截短，5’端1位和2位的堿基可以包含任意突變，所述位置相對(duì)于e3p確定；

13、所述定向進(jìn)化區(qū)為：

14、tj11-3定向進(jìn)化區(qū)：gcgctgtgtaacgtgcatggtgagttacgcgcga?gatagtac(seq?idno.61)；

15、所述e3p的序列為：

16、e3p(5’-aagtggtgcccggaaagg?gtga?ctca-底物識(shí)別區(qū)-3’)。

17、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述“位于”的含義為插入可變區(qū)，或替代可變區(qū)的部分或全部堿基。

18、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述定向進(jìn)化區(qū)替代e3p的21-23位(5’→3’)。

19、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述5’引物識(shí)別區(qū)為atacag。

20、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，底物識(shí)別區(qū)為大于10nt的任意dna序列，優(yōu)選5’-tcagttcatag-3’。

21、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述dnazyme的5’端與底物連接形成順式結(jié)構(gòu)。

22、本發(fā)明第三方面提供耐有機(jī)溶劑的rna切割型dnazyme，包括：

23、1)下述表格中的酶：

24、

25、2)在1)中酶的5’端引入atacag；

26、3)在1)中酶的5’端第1位或第2位，第21、22、23、24或25引入任選的突變，其中所述位置以e3p為參照基準(zhǔn)；

27、4)在1)中酶的3’端引入任意長(zhǎng)度優(yōu)選6nt的堿基序列，優(yōu)選為gtccga；

28、5)在1)中酶的3’端引入不超過(guò)6nt的截短，優(yōu)選不超過(guò)3nt的截短，即底物識(shí)別區(qū)可以小于10nt；

29、6)上述2-5)的酶的5’端與底物連接形成順式結(jié)構(gòu)；

30、7)上述2-6)的任意組合。

31、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述dnazyme為：

32、

33、其中：a突變b(b＝c/g/t)、g突變h(h＝a/t/c)、t突變v(v＝a/g/c)、c突變d(d＝g/a/t)。

34、本發(fā)明第四方面提供上述dnazyme切割底物反應(yīng)的用途。

35、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述切割在包含有機(jī)溶劑的溶液中進(jìn)行，優(yōu)選地，所述有機(jī)溶劑選自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺。

36、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述切割在二價(jià)金屬陽(yáng)離子存在下進(jìn)行，優(yōu)選mg2+或mn2+；

37、優(yōu)選地，所述切割產(chǎn)生熒光；

38、優(yōu)選地，所述切割用于分析檢測(cè)特別是生物樣本的分析檢測(cè)；

39、優(yōu)選地，所述切割用于dna或rna等核酸的分析檢測(cè)；

40、優(yōu)選地，所述切割用于分析檢測(cè)信號(hào)的放大。

41、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述dnazyme切割的底物為：

42、

43、說(shuō)明：f在序列中間代表6-fam熒光修飾的中間堿基dt，ra為rna堿基a，q在序列中間為淬滅基團(tuán)dabcyl修飾的中間dt；f在5’端為dna序列5’端的6-fam修飾。

44、本發(fā)明第五方面提供靶序列核酸激活的多組分dnazyme，所述多組分dnazyme包含如下部分：

45、a)l部分：由本發(fā)明第二方面或第三方面所述的dnazyme自合適位點(diǎn)劈開(kāi)的5’端片段，在3’端連接靶序列識(shí)別片段l；

46、b)r部分，由本發(fā)明第二方面或第三方面所述的dnazyme自合適位點(diǎn)劈開(kāi)后的3’端片段，在5’端連接靶序列識(shí)別片段r；

47、其中靶標(biāo)識(shí)別片段r和靶標(biāo)識(shí)別片段l識(shí)別靶序列的連續(xù)部分或間隔小于10nt，優(yōu)選小于5nt，更優(yōu)選小于2nt的兩個(gè)部分，所述識(shí)別為堿基互補(bǔ)配對(duì)；

48、所述靶標(biāo)為單鏈dna、雙鏈dna、單鏈rna或雙鏈rna；

49、優(yōu)選地，所述合適位點(diǎn)位于底物識(shí)別區(qū)和催化區(qū)之間；

50、所述優(yōu)選合適位點(diǎn)為以tj11-3作為參考序列的c70(5’→3’)位點(diǎn)，所述劈開(kāi)為c70位于r部分或l部分。

51、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述靶序列為sars-cov-2病毒不同基因片段(a、e、n、f)的保守序列(30nt)靶序列，所述靶序列和相應(yīng)多組分dnazyme的兩相應(yīng)部分為：

52、

53、本發(fā)明第六方面提供上述多組分dnazyme在制備核酸如dna和rna檢測(cè)或病原體檢測(cè)或疾病診斷試劑盒中的應(yīng)用。

54、本發(fā)明第七方面提供一種信號(hào)放大器，包含上述的dnazyme酶和偶聯(lián)的生物識(shí)別元件例如抗體和適體；

55、優(yōu)選地，所述信號(hào)放大器在有機(jī)溶劑體系中使用。

56、本發(fā)明第八方面提供一種試劑盒，包含上述的dnazyme酶，或上述的的多組分dnazyme，或上述的信號(hào)放大器。

57、有益效果：

58、1.本發(fā)明提出的篩選文庫(kù)的構(gòu)建有助于得到高活性rna切割型dnazyme。

59、2.本發(fā)明耐有機(jī)溶劑的dnazyme(tj11-3)在多種有機(jī)溶劑存在下具有很高的催化rna底物切割的活性，其中在甲醇緩沖液下催化轉(zhuǎn)換速率高達(dá)44.68min-1，是國(guó)際上公認(rèn)的同類型催化效率最快的rna切割型dnazyme(10-23)的4倍。

60、3.本發(fā)明耐有機(jī)溶劑的dnazyme(tj11-3)自身具有高催化活性，具有催化底物多轉(zhuǎn)換的能力，可以作為在有機(jī)溶劑環(huán)境中傳感器的信號(hào)輸出或信號(hào)放大工具。

61、4.本發(fā)明耐有機(jī)溶劑的dnazyme(tj11-3)可被設(shè)計(jì)成核酸序列激活的多組分dnazyme(mnazyme)，可對(duì)dna和rna序列產(chǎn)生高選擇性和高靈敏度響應(yīng)，將有可能應(yīng)用于快速檢測(cè)不同形式的核酸序列，例如microrna或rna病毒(如新型冠狀病毒和流感病毒)等。