本發(fā)明屬于微生物，具體涉及一種無動物源性培養(yǎng)基及用其培養(yǎng)小克里斯滕森氏菌的方法。

背景技術(shù)：

1、小克里斯滕森氏菌(christensenella?minua)隸屬厚壁菌門、梭狀桿菌綱、梭狀桿菌目中的一種革蘭氏陰性菌，是腸道高豐度共生菌之一?？死锼闺暇哂刑墙庑裕僧a(chǎn)生較大量乙酸鹽和少量丁酸鹽。研究表明，小克里斯滕森氏菌與多種代謝疾病相關(guān)，如肥胖、糖尿病、高血脂等，也與免疫疾病相關(guān)，如炎癥性腸病，此外還與黑色素瘤、帕金森等也有一定關(guān)聯(lián)，小克里斯滕森氏菌作為衡量腸道微生態(tài)平衡的標(biāo)志性微生物之一。由于近年對小克里斯滕森氏菌的一系列重要發(fā)現(xiàn)，特別是在代謝性相關(guān)疾病當(dāng)中的治療作用，使其成為具有重大應(yīng)用及開發(fā)價值的“二代益生菌(ngp)”——生物活體治療性藥物(lbp)的重要候選菌株，作為新型候選益生菌，小克里斯滕森氏菌的培養(yǎng)顯得尤為重要。

2、傳統(tǒng)的用于培養(yǎng)小克里斯滕森氏菌的培養(yǎng)基含有動物源成分，且營養(yǎng)較為豐富，如pyg、改良gam等培養(yǎng)基，其中果糖、葡萄糖等是良好碳源，而牛肉膏則是良好氮源。雖培養(yǎng)結(jié)果尚可，但傳統(tǒng)用于培養(yǎng)小克里斯藤森氏菌的培養(yǎng)基組分偏多，配制過程較為繁瑣，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。此外，牛肉膏雖是良好的氮源，來源于動物組織或消化物，而來源于動物的成分可能含有病毒、朊病毒或細菌來源的污染物，或含有抗敏原、抗原肽或其他不期望的成分，還可能會攜帶未知的病毒和其他危險成分；動物源性培養(yǎng)基主要采用牛肉膏，其復(fù)合成分及其比例并不清楚，也不固定，較易產(chǎn)生性能不穩(wěn)定的情況，造成前后批次結(jié)果不一致，培養(yǎng)基的質(zhì)量不穩(wěn)定和不規(guī)范，直接影響微生物檢驗和研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。從而導(dǎo)致檢測結(jié)果不具有可比性。因此，動物源成分的培養(yǎng)基的安全性和穩(wěn)定性無法得到充分保障。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、基于以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種無動物源性培養(yǎng)基，采用該無動物源性培養(yǎng)基培養(yǎng)小克里斯滕森氏菌的過程中，小克里斯滕森氏菌繁殖快。

2、第一方面

3、本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基中不包含動物源性的組分。

4、在一些實施方案中，動物源性的組分為牛源性組分，例如牛肉膏、牛肉提取物、牛肉粉、牛肝提取物等。

5、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基用于培養(yǎng)小克里斯滕森氏菌。

6、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

7、25g/l～50g/l酵母浸粉、15g/l～45g/l植物蛋白胨、5g/l～8g/l糖類、0.01g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.5g/l～3g/l碳酸鈉、1g/l～3g/l磷酸氫二鉀。

8、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

9、25g/l～50g/l酵母浸粉、15g/l～45g/l植物蛋白胨、5g/l～8g/l糖類、0.01g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.5g/l～3g/l碳酸鈉、1g/l～3g/l磷酸氫二鉀、1.5g/l～4g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物。

10、在一些實施方案中，植物蛋白胨為大豆蛋白胨。

11、在一些實施方案中，糖類選自可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖，優(yōu)選為果糖。

12、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

13、25g/l～50g/l酵母浸粉、15g/l～45g/l植物蛋白胨、5g/l～8g/l糖類、0.01g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.5g/l～3g/l碳酸鈉、1g/l～3g/l磷酸氫二鉀、1.5g/l～4g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、水。

14、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

15、25g/l～50g/l酵母浸粉、15g/l～45g/l大豆蛋白胨、5g/l～8g/l果糖、0.01g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.5g/l～3g/l碳酸鈉、1g/l～3g/l磷酸氫二鉀、1.5g/l～4g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、水。

16、在一些實施方案中，用水添加至1l。

17、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基中，

18、酵母浸粉為35g/l～50g/l，優(yōu)選為35g/l～40g/l；

19、和/或，大豆蛋白胨為25g/l～40g/l，優(yōu)選為25g/l～35g/l；

20、和/或，果糖為5g/l～8g/l，優(yōu)選為5g/l～6g/l；

21、和/或，無水硫酸鎂為0.03g/l～0.08g/l，優(yōu)選為0.03g/l～0.05g/l；

22、和/或，l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物為0g/l～4.0g/l，優(yōu)選為2.0g/l～2.5g/l；

23、和/或，碳酸鈉為0.8g/l～3.0g/l，優(yōu)選為0.8g/l～1.2g/l；

24、和/或，磷酸氫二鉀為1.5g/l～3.0g/l，優(yōu)選為1.5g/l～2.0g/l。

25、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

26、35g/l～50g/l酵母浸粉、25g/l～40g/l大豆蛋白胨、5g/l～8g/l果糖、0.03g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.8g/l～3.0g/l碳酸鈉、1.5g/l～3.0g/l磷酸氫二鉀、0g/l～4.0g/ll-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、水；

27、用水添加至1l。

28、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

29、35g/l～40g/l酵母浸粉、25g/l～35g/l大豆蛋白胨、5g/l～6g/l果糖、0.03g/l～0.05g/l無水硫酸鎂、0.8g/l～1.2g/l碳酸鈉、1.5g/l～2.0g/l磷酸氫二鉀、2.0g/l～2.5g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、水；

30、用水添加至1l。

31、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基還包括吐溫80，優(yōu)選地包括1g/l～3g/l吐溫80，例如1g/l吐溫80。

32、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

33、35g/l～50g/l酵母浸粉、25g/l～40g/l大豆蛋白胨、5g/l～8g/l果糖、0.03g/l～0.08g/l無水硫酸鎂、0.8g/l～3.0g/l碳酸鈉、1.5g/l～3.0g/l磷酸氫二鉀、0g/l～4.0g/ll-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、1g/l～3g/l吐溫80、水；

34、用水添加至1l。

35、在一些實施方案中，所述培養(yǎng)基包括以下組分：

36、35g/l～40g/l酵母浸粉、25g/l～35g/l大豆蛋白胨、5g/l～6g/l果糖、0.03g/l～0.05g/l無水硫酸鎂、0.8g/l～1.2g/l碳酸鈉、1.5g/l～2.0g/l磷酸氫二鉀、2.0g/l～2.5g/l?l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、1g/l吐溫80、水；

37、用水添加至1l。

38、本發(fā)明所述無動物源性培養(yǎng)基中，各組分的濃度為使用過程中的濃度。

39、第二方面

40、本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基的制備方法，所述制備方法包括：

41、將上述培養(yǎng)基中的各組分混合，溶解完成，高溫滅菌。

42、第三方面

43、本發(fā)明還提供上述培養(yǎng)基在培養(yǎng)小克里斯藤森氏菌中的應(yīng)用。

44、第四方面

45、本發(fā)明還提供一種小克里斯藤森氏菌的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括：

46、將小克里斯藤森氏菌接種至上述培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

47、在一些實施方案中，培養(yǎng)方法包括：

48、將小克里斯滕森氏菌接種至種子培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)制備種子液，以及將種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵培養(yǎng)；

49、所述種子培養(yǎng)基和/或所述發(fā)酵培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基。

50、在一些實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：厭氧培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為36℃～38℃，發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為100rpm～350rpm，發(fā)酵培養(yǎng)的時長為30h～50h，發(fā)酵培養(yǎng)的接種濃度為2.0e+08cfu/ml～8.0e+08cfu/ml。

51、在一些實施方案中，發(fā)酵培養(yǎng)的溫度例如為36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃，發(fā)酵培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速例如為100rpm、150rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，發(fā)酵培養(yǎng)的時長例如為30h、32h、34h、36h、38h、40h、42h、44h、46h、48h、50h。

52、在一些實施方案中，活化培養(yǎng)的條件為：厭氧培養(yǎng)，活化培養(yǎng)的溫度為36℃～38℃，活化培養(yǎng)為靜態(tài)培養(yǎng)，活化培養(yǎng)的次數(shù)2次～3次，每次活化培養(yǎng)的時長為28h～70h。

53、在一些實施方案中，活化培養(yǎng)的溫度例如為36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃。

54、本發(fā)明所述的活化是逐級活化，活化1次制備一級種子液，一級種子液經(jīng)第2次活化制備二級種子液，以此類推。

55、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

56、本發(fā)明將適量的酵母浸粉、大豆蛋白胨、果糖、無水硫酸鎂、l-半胱氨酸鹽酸鹽·一水合物、碳酸鈉和磷酸二氫鉀，形成無動物源性液體培養(yǎng)基，采用該無動物源性培養(yǎng)基培養(yǎng)小克里斯藤森氏菌的過程中，小克里斯藤森氏菌增殖快。并且采用該無動物源性培養(yǎng)基培養(yǎng)的小克里斯藤森氏菌生長狀態(tài)好，安全性好，易操作和控制，培養(yǎng)時長短，滿足作為藥用價值的工業(yè)要求。另外，采用本發(fā)明的無動物源性培養(yǎng)基培小克里斯藤森氏菌，活菌數(shù)高、菌株活力高、傳代穩(wěn)定性好，并可放大進行工業(yè)化生產(chǎn)。