本發(fā)明屬于藥物中間體化學(xué)合成，具體涉及一種基于酰胺水解酶合成2-氨基-6-氯鳥嘌呤的方法。

背景技術(shù)：

1、2-氨基-6-氯鳥嘌呤是一種重要的醫(yī)藥中間體，是合成嘌呤類抗病毒藥物泛昔洛韋、阿巴卡韋、噴昔洛韋的重要中間體，還可用于抗癌、降血壓藥物合成。

2、專利文獻(xiàn)cn107312003a公開一種高純度2-氨基-6-氯鳥嘌呤的合成方法，以鳥嘌呤為原料，在有機(jī)溶劑中與viismeier試劑于150-160℃下攪拌反應(yīng)1-2h，得到氯代中間體2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤，所述氯代中間體在堿性水溶液作用下水解，分離純化得到2-氨基-6-氯鳥嘌呤。其中，viismeier試劑是由雙(三氯甲基)碳酸酯與n,n-二取代酰胺在0-10℃下攪拌反應(yīng)1h得到。經(jīng)過(guò)所述方法制備得到的2-氨基-6-氯鳥嘌呤經(jīng)hplc測(cè)定純度達(dá)99.0％以上，公開的具體實(shí)施例中，純度最高達(dá)到99.6％。

3、專利文獻(xiàn)cn114437071a公開一種嘌呤類衍生物的制備工藝，包括如下步驟：(1)氯化：向反應(yīng)釜中加入二氯乙烷、鳥嘌呤和二甲基甲酰胺，升溫至45-80℃，緩慢滴加三氯氧磷后，保溫2-4h，然后升溫至60-90℃攪拌8-15小時(shí)，降溫至15℃-45℃；將氯化反應(yīng)液中的固液分離得氯化物中間體和母液；(2)水解：向盛有所述氯化物中間體的反應(yīng)釜中加入水，降溫至10-30℃，滴加液堿，控制反應(yīng)釜內(nèi)溶液ph＝3.0-5.0，升溫至55-75℃，攪拌反應(yīng)4-8h后，加入酸調(diào)節(jié)ph＝0-1.0，反應(yīng)2-5h后，離心出料，得嘌呤類衍生物2-氨基-6-氯嘌呤粗品。根據(jù)所述方法制備得到的2-氨基-6-氯嘌呤重量收率可達(dá)到100％。

4、專利文獻(xiàn)cn114031620a公開一種高純度2-氨基-6-氯鳥嘌呤生產(chǎn)方法，所述方法包括：(1)使用鳥嘌呤、dmf、氯化試劑進(jìn)行氯代反應(yīng)；(2)淬滅氯代反應(yīng)；(3)酸水解得到2-甲酰胺-6-氯鳥嘌呤；(4)堿水解得到2-氨基-6-氯鳥嘌呤粗品；(5)使用dmf精制，得到純度＞99％，鳥嘌呤含量＜0.2％的產(chǎn)物。

5、從現(xiàn)有技術(shù)公開的情況可以了解到，目前常規(guī)的2-氨基-6-氯鳥嘌呤合成方法是以鳥嘌呤為起始原料，鳥嘌呤先與n,n-二甲基甲酰胺在poci3的作用下反應(yīng)生成2-二甲氨基甲烯亞氨基-6-氯鳥嘌呤，再于酸性條件下水解得到氯代中間體2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤，再經(jīng)過(guò)堿水解得到2-氨基-6-氯鳥嘌呤。該方法的總收率約為55％，操作較為繁瑣，廢水量較高，三廢污染嚴(yán)重。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在堿水解的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生雜質(zhì)鳥嘌呤，且難以除去，導(dǎo)致成品中鳥嘌呤雜質(zhì)偏高。

6、基于以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種2-氨基-6-氯鳥嘌呤的合成方法，采用酰胺水解酶對(duì)氯代中間體2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤進(jìn)行水解，與現(xiàn)有技術(shù)中直接采用堿水解相比，本發(fā)明提供的方法制備得到的產(chǎn)物鳥嘌呤雜質(zhì)含量少，反應(yīng)時(shí)間少，并且制備過(guò)程產(chǎn)生的廢水量少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種合成2-氨基-6-氯鳥嘌的方法，所述方法使用本發(fā)明制備的重組酰胺水解酶作用于氯代中間體2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤，制備得到2-氨基-6-氯鳥嘌；本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組酰胺水解酶在制備2-氨基-6-氯鳥嘌中的用途；本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種重組酰胺水解酶及其制備方法。

2、第一方面，本發(fā)明提供一種2-氨基-6-氯鳥嘌的合成方法，其特征在于，所述方法為：向2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤水溶液中加入酰胺水解酶，反應(yīng)3-5h，得到2-氨基-6-氯鳥嘌。

3、反應(yīng)過(guò)程如下所示：

4、

5、優(yōu)選的，所述2-氨基-6-氯鳥嘌的合成方法包括如下步驟：

6、(1)室溫下，將2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤溶于水中形成水溶液；

7、(2)升溫至37℃，使用堿調(diào)節(jié)ph至7.0；

8、(3)加入酰胺水解酶，保溫反應(yīng)3-5h；

9、(4)抽濾，得到2-氨基-6-氯鳥嘌呤。

10、所述方法中的2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)公開的任意方法制備得到。

11、優(yōu)選的，在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤通過(guò)如下方法制備得到：以鳥嘌呤為原料，與二氯乙烷、n,n-二甲基甲酰胺在三氯氧磷的作用下反應(yīng)生成2-二甲氨基甲烯亞氨基-6-氯鳥嘌呤，再于酸性條件下水解得到2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤。

12、反應(yīng)過(guò)程如下所示：

13、

14、本發(fā)明所述的酰胺水解酶可以是任意可通過(guò)商購(gòu)?fù)緩劫?gòu)買的酰胺水解酶。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述酰胺水解酶是本發(fā)明技術(shù)人員自行制備得到的一種重組酰胺水解酶。

15、所述的重組酰胺水解酶的序列選自下列氨基酸序列中的一種：

16、a)由seq?id?no:1的氨基酸序列組成；

17、b)與seq?id?no:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；

18、c)與seq?id?no:1的氨基酸的差異不超過(guò)10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過(guò)1個(gè)的序列。

19、seq?id?no:1所示的氨基酸序列：

20、mqpnditffqrfqddilagrktitirdeseshfktgdvlrvgrfeddgy?fctievtatstvtldtltekhaeqenmtltelkkviadiypgqtqfyviefkc?l。

21、在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，所述重組酰胺水解酶通過(guò)如下方法制備得到：

22、將seq?id?no.2所示的核苷酸序列連接質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌，培養(yǎng)重組菌使其表達(dá)得到重組酰胺水解酶。

23、seq?id?no:2所示的核苷酸序列：

24、atgcagccaaacgacatcactttttttcaacgtttccaggatgacattctggctgggcgtaaaaccatcaccatccgcgacgagtctgaatcgcacttcaaaacgggtgatgtgcttcgtgtcggacgttttgaagatgacggttatttttgcacgattgaagtcaccgcaacctcaaccgtaacgctggatacgctgactgaaaaacatgcagagcaggaaaatatgaccctgactgaactgaaaaaagtcattgctgacatctatcccggtcagacacaattttatgtgattgaatttaaatgtctttaa。

25、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述重組酰胺水解酶的制備方法如下：

26、(1)將seq?id?no.2所示的核苷酸序列與pet-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至bl21(de3)，獲得重組菌；

27、(2)過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pet-28a(+)-酰胺水解酶；

28、(3)抽提經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒接種至lb中，利用卡那霉素抗性篩選出構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)化子，iptg誘導(dǎo)獲得重組蛋白；

29、(4)將重組蛋白進(jìn)行分離純化，得到重組酰胺水解酶。

30、第二方面，本發(fā)明提供一種重組酰胺水解酶，其特征在于，所述重組酰胺水解酶的序列選自下列氨基酸序列中的一種：

31、a)由seq?id?no:1的氨基酸序列組成；

32、b)與seq?id?no:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；

33、c)與seq?id?no:1的氨基酸的差異不超過(guò)10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超過(guò)1個(gè)的序列。

34、第三方面，本發(fā)明提供一種重組酰胺水解酶的制備方法，包括將seq?id?no.2所示的核苷酸序列連接質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌bl21(de3)，得到重組菌，培養(yǎng)重組菌使其表達(dá)得到酰胺水解酶。

35、優(yōu)選的，所述酰胺水解酶的制備方法如下：

36、(1)將seq?id?no.2所示的核苷酸序列與pet-28a(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切后連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至bl21(de3)，獲得重組菌；

37、(2)過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pet-28a(+)-酰胺水解酶；

38、(3)抽提經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒接種至lb中，利用卡那霉素抗性篩選出構(gòu)建成功的轉(zhuǎn)化子，iptg誘導(dǎo)獲得重組蛋白；

39、(4)將重組蛋白進(jìn)行分離純化，得到酰胺水解酶。

40、第四方面，本發(fā)明提供一種重組酰胺水解酶在制備2-氨基-6-氯鳥嘌中的用途。

41、優(yōu)選的，所述重組酰胺水解酶的作用底物是2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤。

42、本發(fā)明提供的基于重組酰胺水解酶制備2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤的方法具有如下技術(shù)效果：1，與常規(guī)的堿水解相比，使用本發(fā)明提供的重組酰胺水解酶進(jìn)行水解得到的產(chǎn)物純度高，不需要經(jīng)過(guò)精制便可達(dá)到99.7％，鳥嘌呤含量低于0.2％與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯進(jìn)步；2，與常規(guī)的堿水解相比，使用本發(fā)明提供的重組酰胺水解酶進(jìn)行水解制備2-甲酰胺基-6-氯鳥嘌呤的方法，反應(yīng)溫和，適用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)；3，本發(fā)明提供的重組酰胺水解酶與市售的具有相同效果的酶相比，反應(yīng)活性更高。