本發(fā)明涉及水稻微生物定向演化領(lǐng)域，尤其涉及一種自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法。

背景技術(shù)：

1、水稻是世界上最重要、消耗最大的糧食作物之一，據(jù)聯(lián)合國估計，到2050年，世界人口將達到98億。而農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力預計要提高70％，才能滿足日益增長的糧食、飼料、纖維和生物能源等需求。由于耕地面積有限，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力的提升更多地寄希望于對農(nóng)作物品種的改造以及高效肥料和殺蟲劑等的創(chuàng)制。自20世紀80年代以來，水稻生產(chǎn)中單位面積化肥投入不斷增加，當前有的農(nóng)戶施氮量已經(jīng)高達260kg?hm-2，遠高于合理施氮量150kg?hm-2的水平。

2、大量的氮肥投入不僅加劇硝態(tài)氮肥的淋失和銨態(tài)氮肥的揮發(fā)，帶來土壤板結(jié)、酸化、微生物群體結(jié)構(gòu)破壞、地表水或地下水的硝酸鹽含量嚴重超標等系列生態(tài)環(huán)境污染，同時嚴重危害農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。而植物相關(guān)的微生物具有許多促進植物生長和生物修復的特性，在人類應對這些挑戰(zhàn)上具有巨大的潛力。微生物可以以直接或間接的方式促進植物的生長，直接調(diào)控包括調(diào)節(jié)必需營養(yǎng)元素，如氮、磷和鐵的獲取以及調(diào)節(jié)激素水平等方式，間接調(diào)控則通過抗生素產(chǎn)生拮抗作用，響應病原菌的感染等途徑，故而通過自上而下的定向進化方法挑選最適宜水稻幼苗生長的微生物組。

3、因此，有必要提供一種新的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法解決上述技術(shù)問題。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種篩選對水稻幼苗生長具有顯著促生效果的微生物菌群的自上而下微生物組定向演化方法。

2、自上而下的定向進化是一種人工選擇形式，為合成生物學的發(fā)展提供了一種簡單高效工具，即通過迭代培養(yǎng)，基于基因型-表型圖以尋找高生物功能的穩(wěn)定菌群。該策略前期的研究工作集中在菌群馴化，通過物理化學環(huán)境的設(shè)計引導現(xiàn)有的微生物組發(fā)生生態(tài)選擇，以執(zhí)行期望的生物過程；后期利用宏基因組技術(shù)進行信息挖掘。當前，生物技術(shù)應用常常需要對多基因性狀進行復雜的工程化改造，然而復雜表型的遺傳基礎(chǔ)背景的缺乏限制了人們進行理性設(shè)計的能力。利用合成生物學工具可以對復雜表型在系統(tǒng)水平進行工程化改造，通過定向進化策略推動整個生物系統(tǒng)的進化，在不知道目標性狀的遺傳基礎(chǔ)的情況下仍可以獲得人們所期望的表型。復雜性狀的工程化可以通過定向進化的策略來實現(xiàn)，通過多種控制設(shè)置模擬自然進化過程，達到人們所需的表型。自適應實驗室進化技術(shù)就是其中一個例子，在特定選擇條件下對微生物進行培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)百代的培養(yǎng)后就可實現(xiàn)表型改進的進化。許多利用ale方法對大腸桿菌和酵母菌進行工程化改造的研究，成功地提高了生物燃料或化學品的產(chǎn)量和產(chǎn)率。因此，定向進化可能使我們在基因型空間迄今未探索到的區(qū)域中找到全新的路徑和機制。定向進化策略通常依賴于人工選擇壓力和多代循環(huán)擴增來改進突變體，最終得到所需的復雜表型。其成功與否主要取決于兩點因素，即產(chǎn)生功能多樣化突變體的能力以及鑒定出真正表型改進突變體的篩選方法。近些年來，合成生物學領(lǐng)域的發(fā)展迅猛對定向進化策略做出了重要貢獻，其領(lǐng)域的目標是設(shè)計、構(gòu)建和改進自然界不存在的生物組分及系統(tǒng)。合成生物學已發(fā)展出了很多可以加速定向進化的工具，可提高產(chǎn)生多樣性子代的效率，同時也可以擴展篩選或選擇范圍。

3、本發(fā)明提供的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法包括以下步驟：

4、步驟一：挑選12個水稻土壤環(huán)境樣本，將其中一個環(huán)境樣本取出1.0g并置于15ml無菌試管中，重懸于10ml磷酸鹽緩沖鹽水中以抑制真核細胞生長，磷酸鹽緩沖鹽水簡稱pbs；樣品通過渦旋均勻化，上清液用作實驗的接種物；同理按照上述方式將12個環(huán)境樣本的初始菌液上清液分別接種到lb培養(yǎng)基中作為初始接種庫，每個樣本均設(shè)置8個平行樣本形成96組樣本；分別取96個接種庫中的4μl子樣本在新的96孔板中用pbs以1:103的比例稀釋后，通過瓶頸擾動和外源隨機添加菌群形成盡可能多樣的微生物菌群組合，瓶頸擾動簡稱bottleneck，外源隨機添加菌群簡稱migration；經(jīng)過15輪無選擇迭代，每輪迭代即轉(zhuǎn)移至新的lb培養(yǎng)液中；

5、步驟二：將步驟一中經(jīng)過15輪無選擇迭代的菌群分別接種到霍格蘭營養(yǎng)液；

6、步驟三：將步驟二中的添加菌群后的營養(yǎng)液樣本分別等量添加進入水稻幼苗培養(yǎng)皿樣本中；

7、步驟四：每隔五天觀察一次水稻長勢，檢測水稻葉長根長等形態(tài)指標，通過葉長根長等形態(tài)指標篩選長勢較好的接種菌群作為新一輪傳代的母代；

8、步驟五：將步驟四中篩選的接種菌群重復步驟一至四，并循環(huán)5次篩選出生物功能最高的微生物菌群，微生物菌群稱為定向進化微生物組1。

9、優(yōu)選的，步驟一中bottleneck(瓶頸擾動)：這種方法涉及讓每個群落單元接受稀釋步驟。

10、優(yōu)選的，步驟一中migration(外源隨機添加菌群)：這種方法包括通過入侵一組從不同環(huán)境微生物組中抽樣的隨機物種來擾亂群落。

11、優(yōu)選的，步驟三中營養(yǎng)液樣本數(shù)目與水源幼苗培養(yǎng)基樣本數(shù)目相同。

12、與相關(guān)技術(shù)相比較，本發(fā)明提供的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法具有如下有益效果：

13、通過一種人工選擇促生微生物組的方法，該微生物組對水稻幼苗生長期具有顯著促生效果，且對不同水稻品種具有普適性。在受控的溫室環(huán)境中，在非進化秈型常規(guī)水稻9311之間差異地傳播微生物組；因此，在實驗中只有微生物組進化，但植物沒有平行進化。簡單來說就是，將來源各異的水稻土壤微生物組作為一個菌庫，通過稀釋(bottleneck)和外源隨機添加菌群(migration)形成盡可能多樣的微生物菌群組合，經(jīng)過15輪無選擇迭代后，接種到霍格蘭營養(yǎng)液中用于水稻幼苗生長，基于水稻生理指標(葉長、根長及對應的鮮干重)和微生物生理指標(赤霉素、吲哚乙酸、產(chǎn)鐵載體能力)篩選出對水稻幼苗具有顯著促生效果的菌群作為下一代培養(yǎng)的親代，利用bottleneck和migration結(jié)合策略形成新的母代進行新的一輪無選擇迭代培養(yǎng)，以篩選生物功能最高的水稻促生微生物組。

技術(shù)特征：

1.一種自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法，其特征在于，步驟一中bottleneck(瓶頸擾動)：這種方法涉及讓每個群落單元接受稀釋步驟。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法，其特征在于，步驟一中migration(外源隨機添加菌群)：這種方法包括通過入侵一組從不同環(huán)境微生物組中抽樣的隨機物種來擾亂群落。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法，其特征在于，步驟三中營養(yǎng)液樣本數(shù)目與水源幼苗培養(yǎng)基樣本數(shù)目相同。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法。所述自上而下的水稻促生微生物組定向演化方法包括以下步驟：步驟一：選擇對水稻幼苗具有促生效果的微生物組采用Bottleneck+Migration結(jié)合至LB培養(yǎng)基進行迭代培養(yǎng)，經(jīng)過15輪無選擇迭代，每輪迭代即轉(zhuǎn)移至新的LB培養(yǎng)液中；步驟二：將步驟一中經(jīng)過15輪無選擇迭代的菌群分別接種到霍格蘭營養(yǎng)液；步驟三：將步驟二中的添加菌群后的營養(yǎng)液樣本分別等量添加進入水稻幼苗培養(yǎng)皿樣本中；步驟四：每隔五天觀察一次水稻長勢，檢測水稻葉長根長等形態(tài)指標；步驟五：將步驟四中篩選的接種菌群重復步驟一至四，并循環(huán)5次；本發(fā)明具有篩選出顯著促進水稻幼苗生長的微生物組優(yōu)點。

技術(shù)研發(fā)人員：董慧蕓,馬斌,徐建明
受保護的技術(shù)使用者：浙江大學
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9