本發(fā)明屬于生物，具體涉及一種與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、煙草是一種葉用經(jīng)濟(jì)作物，煙葉中含有多種化學(xué)元素，目前已鑒定的化學(xué)成分達(dá)3000種以上，但隨著氣相色譜(gc)、液相色譜(lc)、氣相色譜-質(zhì)譜(gc-ms)、液相色譜-質(zhì)譜(lc-ms)、紅外光譜(ir)、核磁共振(nmr)及高分辨率質(zhì)譜等現(xiàn)代分離分析儀器在煙草研究中的應(yīng)用，將使曾經(jīng)被掩蓋的微量成分被揭示出來，進(jìn)而使煙葉化學(xué)成分?jǐn)?shù)量急劇增加。作為卷煙工業(yè)基礎(chǔ)的煙葉原料，其品質(zhì)的好壞直接影響卷煙成品質(zhì)量。而煙葉品質(zhì)是其葉片內(nèi)多種化學(xué)成分綜合作用的結(jié)果，因此，煙葉化學(xué)成分是煙葉品質(zhì)鑒定的重要指標(biāo)，也是外觀質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量在外觀特征和煙氣特征上的表現(xiàn)。

2、迄今，針對(duì)煙葉化學(xué)成分的研究主要集中在煙葉化學(xué)成分的鑒定及主要化學(xué)成分與評(píng)吸質(zhì)量、外觀質(zhì)量、物理特性和安全性等方面的密切關(guān)聯(lián)，而針對(duì)煙葉化學(xué)成分的遺傳分析及基因/qtl定位研究很少。julio等(e.julio,b.denoyes-rothan,j.-l.verrier,f.dorlhac?de?borne,detection?of?qtls?linked?to?leaf?and?smoke?properties?innicotiana?tabacum?based?on?a?study?of?114?recombinant?inbred?lines.molbreeding,2006,doi?10.1007/s11032-006-9019-0)是最早利用aflp、issr、ssap和scar標(biāo)記在分子水平上開展煙葉化學(xué)成分基因/qtl定位研究的，其對(duì)總植物堿、煙堿(尼古丁)、降煙堿、假木賊堿、檸檬酸和蘋果酸等6種煙葉化學(xué)成分進(jìn)行了初步基因/qtl分析。但該基因/qtl定位分析的結(jié)果卻是不完整且不準(zhǔn)確的，主要原因?yàn)椋菏紫?，julio等(2006)用于基因/qtl定位分析的煙草遺傳連鎖圖譜質(zhì)量較低，僅由184個(gè)標(biāo)記構(gòu)建了18個(gè)連鎖群，尚未達(dá)到煙草的24條染色體(連鎖群)完整要求；其次，其僅獲得了與上述6種煙葉化學(xué)成分連鎖的單側(cè)標(biāo)記，未能獲得與目標(biāo)基因/qtl(6種煙葉化學(xué)成分)連鎖的兩側(cè)標(biāo)記進(jìn)行有效定位；最后，獲得的單側(cè)連鎖標(biāo)記與目標(biāo)基因/qtl間的遺傳距離較大，導(dǎo)致基因/qtl定位結(jié)果的準(zhǔn)確性不高。緊接著，肖炳光等(肖炳光，盧秀萍，焦芳嬋，李永平，孫玉合，郭兆奎，烤煙幾種化學(xué)成分的qtl初步分析.作物學(xué)報(bào)，2008，34(10)：1762-1769.)利用11個(gè)issr標(biāo)記和158個(gè)rapd標(biāo)記構(gòu)建獲得含有27條連鎖群的低質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜，對(duì)總糖、煙堿和氧化鉀等3個(gè)煙葉化學(xué)成分進(jìn)行基因/qtl分析。隨后，蔡長春等(蔡長春，柴利廣，王毅，徐芳森，張俊杰，林國平，白肋煙分子標(biāo)記遺傳圖譜的構(gòu)建及部分性狀的遺傳剖析.作物學(xué)報(bào)，2009，35(9)：1646-1654.)、李麗華等(李麗華，陳美霞，周東新，陳順輝，陶愛芬，李延坤，馬紅勃，祁建民，郭玉春，煙草六個(gè)重要性狀的qtl定位.作物學(xué)報(bào)，2011，37(9)：1577-1584.)和劉穎超等(劉穎超，方敦煌，徐海明，童治軍，肖炳光，煙草生物堿性狀的qtl定位.作物學(xué)報(bào)，2024，50(1)：42-54)分別利用aflp和srap標(biāo)記，issr和srap標(biāo)記及snp標(biāo)記構(gòu)建的較少標(biāo)記數(shù)量低質(zhì)量煙草遺傳連鎖圖譜，對(duì)煙堿(尼古丁)、總氮、總糖、總氯、總鉀、總植物堿、降煙堿、假木賊堿和新煙草堿等9個(gè)煙葉化學(xué)成分進(jìn)行了基因/qtl分析，但定位分析結(jié)果的準(zhǔn)確性仍較低。

3、而針對(duì)煙草果膠的qtl定位分析研究，迄今尚未見報(bào)道。故此，對(duì)煙草果膠性狀遺傳研究與定位分析的空白，嚴(yán)重地制約了利用與煙草果膠基因qpec緊密連鎖標(biāo)記開展高含量果膠煙草新品種的選育進(jìn)程。

4、鑒于此，本發(fā)明首先以優(yōu)質(zhì)烤煙品種y3(烤后煙葉中具有高含量的煙草果膠，含基因qpec)和主栽烤煙品種k326(烤后煙葉中不含煙草果膠)為親本，通過雜交、連續(xù)套袋自交，構(gòu)建一個(gè)含有269份株系的煙草重組自交系(rils_f8:9)為作圖群體；其次，利用本實(shí)驗(yàn)室基于優(yōu)質(zhì)烤煙品種y3基因組信息開發(fā)的大規(guī)模ssr分子標(biāo)記對(duì)269個(gè)rils_f8:9株系進(jìn)行基因型分析，構(gòu)建獲得1張高質(zhì)量煙草ssr分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜含有2059個(gè)ssr標(biāo)記且較均勻分布于煙草24條連鎖群上，覆蓋全基因組長度為1759.74cm；再次，待煙草成熟采烤后，利用離子色譜(ic)法對(duì)烘烤后的c3f級(jí)別中部煙葉進(jìn)行果膠含量檢測；最后，利用數(shù)量性狀連鎖分析(qtl)法并結(jié)合rils_f8:9的基因型數(shù)據(jù)(遺傳連鎖圖譜)和表型數(shù)據(jù)(煙草果膠含量值)，在煙草全基因組范圍內(nèi)篩選獲得與果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，既有效填補(bǔ)了國內(nèi)外關(guān)于煙草果膠性狀qtl定位分析的空白，又獲得與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，是精準(zhǔn)、高效利用分子標(biāo)記輔助選擇(mas)培育高果膠含量烤煙新品種的重要途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明正是為了解決煙草果膠性狀qtl定位分析的空白，提供一種與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記及應(yīng)用。

2、本發(fā)明的第一目的在于提供一種與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記；第二目的在于將上述共顯性ssr標(biāo)記應(yīng)用于檢測煙草基因組dna中是否存在煙草果膠基因qpec及待測植株中的煙草果膠的基因型狀態(tài)。

3、本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)：本發(fā)明首次針對(duì)煙草果膠基因qpec進(jìn)行遺傳與定位分析。本發(fā)明人的研究表明，煙草果膠屬于典型的數(shù)量性狀，且受烤煙品種y3基因組內(nèi)第11條染色體的qtl控制，該基因/qtl被暫命名為qpec。

4、本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

5、一種與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，本發(fā)明所述的與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記的編號(hào)為idyk05838和idyk05784，其pcr擴(kuò)增產(chǎn)物核苷酸序列分別為seq?id?no.1和seq?id?no.2、seq?id?no.3和seq?id?no.4所示。

6、seq?id?no.1：

7、cgtgatatcatgaaacgacgataaattgacacaatccatccaaacattatattcatcaaatgatacactataatacaatacaatacgatacgatacgatacgatacgtaacaaccatccaaacaagctctaaagctttatctattaatattatttatttaaaagtactaatattgaagtaaatatggctattttgtttatcatattaatgaatatggcttgaccga。

8、seq?id?no.2：

9、cgtgatatcatgaaacgacgataaattgacacaatccatccaaacattatattcatcaaatgatacactataatacaatacaatacgatacgatacgatacgatacgatacgatacgtaacaaccatccaaacaagctctaaagctttatctattaatattatttatttaaaagtactaatattgaagtaaatatggctattttgtttatcatattaatgaatatggcttgaccga。

10、seq?id?no.3：

11、taaggggcatgtcaaaggtcaaaaaaacacttattttatggaccagagggagtgttcgattggtgatcaagcaatcaaatgaataaggacataattgtataattaaaccagtacaataaaataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataattcaagcttcaaaccatggagcaccctaaccctaga。

12、seq?id?no.4：

13、taaggggcatgtcaaaggtcaaaaaaacacttattttatggaccagagggagtgttcgattggtgatcaagcaatcaaatgaataaggacataattgtataattaaaccagtacaataaaataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataataattcaagcttcaaaccatggagcaccctaaccctaga。

14、本發(fā)明所述共顯性標(biāo)記idyk05838和idyk05784位于目的基因qpec兩側(cè)。

15、本發(fā)明所述的分子標(biāo)記所對(duì)應(yīng)的2個(gè)位點(diǎn)的引物序列分別為：

16、擴(kuò)增idyk05838的引物序列為：

17、idyk05838f：5’-cgtgatatcatgaaacgacgat-3’(seq?id?no.5)，

18、idyk05838r：5’-tcggtcaagccatattcatt-3’(seq?id?no.6)；

19、擴(kuò)增idyk05784的引物序列為：

20、idyk05784f：5’-taaggggcatgtcaaaggtc-3’(seq?id?no.7)，

21、idyk05784r：5’-tctagggttagggtgctcca-3’(seq?id?no.8)。

22、上述的與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記的應(yīng)用在于檢測煙草基因組dna中是否存在煙草果膠基因qpec及待測植株中的煙草果膠的基因型狀態(tài)。

23、本發(fā)明上述的應(yīng)用，該應(yīng)用的方法為，以idyk05838和idyk05784序列的引物分別擴(kuò)增待檢測煙草基因組dna，檢測pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

24、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有如seq?id?no.1和seq?id?no.3所示序列則表明該待測煙草植株存在高含量煙草果膠的純合等位基因，基因型為pecpec。

25、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有如seq?id?no.2和seq?id?no.4所示序列則為待測煙草植株無煙草果膠含量的純合等位基因，基因型為pecpec。

26、本發(fā)明pcr擴(kuò)增產(chǎn)物中同時(shí)含有如seq?id?no.1和seq?id?no.4所示序列，或同時(shí)含有如seq?id?no.2和seq?id?no.3所示序列則為待測煙草植株存在中等含量煙草果膠的雜合等位基因，基因型為pecpec。

27、為了簡捷高效選擇具有高果膠含量潛力的煙草品種，本發(fā)明特異性地選擇含煙草果膠基因qpec的后代材料，可用于煙草果膠基因qpec的輔助選擇，以提高分子標(biāo)記輔助選擇的效率及高含量果膠煙草品種選育的效率。利用本發(fā)明提供的2個(gè)與煙草果膠基因qpec緊密連鎖的共顯性ssr標(biāo)記，不僅可用于定性檢測任何生育期的煙草基因組dna中是否存在煙草果膠基因qpec，還可以清晰、精準(zhǔn)鑒別待測植株中的煙草果膠的基因型狀態(tài)(即，具有最高含量值且穩(wěn)定遺傳的純合基因型pecpec、具有中等含量值且遺傳不能穩(wěn)定的雜合基因型pecpec、無含量值且穩(wěn)定遺傳的純合基因型pecpec)，進(jìn)而既提高了具有高果膠含量烤煙新品種選育的科學(xué)性、可預(yù)測性，又加速了育種進(jìn)程。

28、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

29、1、填補(bǔ)了國內(nèi)外關(guān)于煙草果膠基因qpec遺傳與定位研究的空白。

30、2、清晰、精準(zhǔn)檢測煙草果膠的基因型狀態(tài)

31、提供了用于檢測煙草果膠基因qpec的分子標(biāo)記，既可精準(zhǔn)確定待測煙草中是否含有煙草果膠，又可清晰的鑒別出待測煙草植株中的果膠的基因型狀態(tài)。

32、3、檢測方法高效、穩(wěn)定、可靠，且操作簡捷和低成本

33、與現(xiàn)有的采用低通量、高成本、耗時(shí)費(fèi)力的ic法檢測成熟并烘烤后的煙草果膠含量相比，本發(fā)明所述的共顯性ssr標(biāo)記具有高效、穩(wěn)定、可靠、簡捷和低成本的特點(diǎn)。

34、4、不限檢測時(shí)機(jī)

35、本方法可在煙草生長的任何時(shí)期進(jìn)行檢測，尤其是在煙草幼苗期的檢測，可極大的縮短了實(shí)驗(yàn)周期，進(jìn)而加速了選育高果膠含量的烤煙新品種進(jìn)程。

36、下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式本發(fā)明做進(jìn)一步解釋。