本發(fā)明涉及熒光探針，更具體的說(shuō)是涉及基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、作為活性氧(ros)的一種，過(guò)氧亞硝酸根離子(onoo-)在生物過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用。細(xì)胞內(nèi)onoo-水平失衡會(huì)氧化細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等，從而引起細(xì)胞代謝失調(diào)。這與很多疾病有著密切聯(lián)系，例如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥等。近年來(lái)，科研工作者已經(jīng)證明了ros在癌癥治療過(guò)程中有著密切的聯(lián)系。因此，ros可以被用來(lái)作為檢測(cè)抗癌治療過(guò)程中的一個(gè)生物靶點(diǎn)。然而，目前仍然缺乏檢測(cè)onoo-的分析工具。

2、迄今為止，檢測(cè)onoo-的方法主要有碘量法、比色法、色譜法、熒光探針?lè)?、電化學(xué)法等。其中由于小分子熒光探針具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)評(píng)估以及其操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，引起了科研工作者對(duì)其極大的關(guān)注。迄今為止，科研工作者已經(jīng)報(bào)道了許多檢測(cè)onoo-的識(shí)別基團(tuán)。盡管已經(jīng)報(bào)道了許多檢測(cè)onoo-的熒光探針，但是超級(jí)快速檢測(cè)氧化應(yīng)激過(guò)程中onoo-水平波動(dòng)的熒光探針仍然很少。因此，構(gòu)建對(duì)onoo-具有高特異性的新型比率型熒光探針并實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞成像的研究仍迫在眉睫。

3、三苯胺，具有原料成本低、合成簡(jiǎn)單、可修飾位點(diǎn)多、熒光量子產(chǎn)率高和光穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)；另外更重要的是，三苯胺類熒光染料的分子量相對(duì)較小、生物相容性好、容易滲透活細(xì)胞、非常適用于生物熒光成像而被廣泛關(guān)注?；诖?，制備基于三苯胺熒光染料專一性響應(yīng)生物細(xì)胞內(nèi)onoo-的比率型熒光探針具有重要意義。

4、因此，提供基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，該探針制備方法操作方便，原料易得，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞內(nèi)onoo-的專一性檢測(cè)。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、一種基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針，所述熒光探針的化學(xué)分子式為：(c38h38bn2o2)+br-，命名為nbonoo，結(jié)構(gòu)式為：

4、

5、進(jìn)一步，所述的一種基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針的制備方法，具體步驟如下：

6、(1)4-二苯胺基苯甲醛和2-甲基吡啶加入無(wú)水乙醇在哌啶的催化作用下，在25℃～35℃攪拌5～6h，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到粗產(chǎn)品；將粗產(chǎn)品通過(guò)硅膠柱層析，使用二氯甲烷/石油醚作為流動(dòng)相，分離得到化合物1；

7、所述4-二苯胺基苯甲醛、2-甲基吡啶、哌啶和無(wú)水乙醇按照摩爾比為1：(1～1.5)：0.1：500的比例混合；

8、所述二氯甲烷/石油醚的體積比為12：1；

9、(2)將步驟(1)制得的化合物1、4-溴甲基苯硼酸頻哪酯用乙腈在81℃～82℃回流攪拌5～6h，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得到粗產(chǎn)品；將粗產(chǎn)品通過(guò)中性氧化鋁柱層析，使用二氯甲烷/甲醇作為流動(dòng)相，分離得到熒光探針；

10、所述化合物1、4-溴甲基苯硼酸頻哪酯和乙腈按照摩爾比為1：(1～2)：300的比例添加；

11、所述二氯甲烷/甲醇的體積比為10：1。

12、進(jìn)一步，步驟(1)所述化合物1的結(jié)構(gòu)式為：

13、

14、進(jìn)一步，所述的熒光探針或所述的制備方法制備得到的熒光探針在制備專一檢測(cè)onoo-試劑中的應(yīng)用。

15、進(jìn)一步，所述熒光探針在制備細(xì)胞專一檢測(cè)onoo-試劑中的應(yīng)用。

16、進(jìn)一步，所述細(xì)胞為mcf-7細(xì)胞。

17、進(jìn)一步，一種用于檢測(cè)onoo-的試劑或試劑盒，包括所述的熒光探針或所述的制備方法制備得到的熒光探針。

18、進(jìn)一步，所述的試劑盒在檢測(cè)onoo-中的應(yīng)用。

19、熒光探針選擇三苯胺衍生物為熒光團(tuán)，苯硼酸酯為識(shí)別團(tuán)。檢測(cè)機(jī)制是onoo-與苯硼酸酯發(fā)生氧化反應(yīng)后發(fā)生1,6-消除，釋放熒光團(tuán)引起熒光信號(hào)變化。熒光探針通過(guò)紫外和熒光光譜儀檢測(cè)onoo-且不受其活性氮和活性氧類的干擾，該檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、靈敏，檢測(cè)限為0.87nm。更重要的是該探針可以檢測(cè)細(xì)胞中的onoo-，在生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。

20、本發(fā)明基于三苯胺染料用于專一檢測(cè)onoo-的比率型熒光探針，該探針在溶液測(cè)試中，利用紫外和熒光光譜可判斷出探針的濃度依賴性關(guān)系；在通過(guò)選擇性和抗干擾能力測(cè)試觀察出，探針可專一性檢測(cè)onoo-，不與活性氧化物反應(yīng)且抗干擾能力強(qiáng)；并且探針的ph穩(wěn)定性強(qiáng)，細(xì)胞毒性小。還可通過(guò)熒光成像技術(shù)達(dá)到對(duì)mcf-7細(xì)胞中的onoo-檢測(cè)的目的。

21、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開(kāi)提供了基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，該熒光探針合成方法簡(jiǎn)單，操作方便；檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)onoo-專一性檢測(cè)，而且不受其他活性氧化物類干擾；檢測(cè)信號(hào)明顯，為比率型熒光探針。

技術(shù)特征：

1.一種基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)式為：

2.權(quán)利要求1所述的一種基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針的制備方法，其特征在于，具體步驟如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于三苯胺染料專一響應(yīng)onoo-的比率型熒光探針的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述化合物1的結(jié)構(gòu)式為：

4.權(quán)利要求1所述的熒光探針或權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的熒光探針在制備專一檢測(cè)onoo-試劑中的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述熒光探針在制備細(xì)胞專一檢測(cè)onoo-試劑中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述細(xì)胞為mcf-7細(xì)胞。

7.一種用于檢測(cè)onoo-的試劑或試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的熒光探針或權(quán)利要求2-3任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的熒光探針。

8.權(quán)利要求7所述的試劑盒在檢測(cè)onoo-中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了基于三苯胺染料專一響應(yīng)ONOO<supgt;?</supgt;的比率型熒光探針及其制備方法和應(yīng)用，屬于熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)的基于三苯胺染料專一響應(yīng)ONOO<supgt;?</supgt;的比率型熒光探針，化學(xué)分子式為：(C<subgt;38</subgt;H<subgt;38</subgt;BN<subgt;2</subgt;O<subgt;2</subgt;)<supgt;+</supgt;Br<supgt;?</supgt;。熒光探針通過(guò)紫外和熒光光譜儀檢測(cè)ONOO<supgt;?</supgt;且不受其活性氮和活性氧類的干擾，該檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便、快速、靈敏，檢測(cè)限為0.87nM。更重要的是該探針可以檢測(cè)細(xì)胞中的ONOO<supgt;?</supgt;，在生物監(jiān)測(cè)領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：沈力,陳淼,駱志國(guó),趙紅艷,鄧鑫州,閆玉濤,董曉霞
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖北醫(yī)藥學(xué)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2