本發(fā)明涉及與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體及其用途。

背景技術(shù)：

1、免疫系統(tǒng)是由各種細(xì)胞和器官組成的生物網(wǎng)絡(luò)，旨在保護(hù)生物體免受外部侵襲。免疫系統(tǒng)基于組成它的器官和細(xì)胞的特定功能以及細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)和相互作用而運(yùn)行。免疫系統(tǒng)通過平衡調(diào)控和調(diào)節(jié)免疫的免疫耐受與增強(qiáng)免疫的免疫應(yīng)答來維持免疫穩(wěn)態(tài)。免疫耐受和免疫反應(yīng)的失衡可能是由各種因素引起的，而這種免疫的失衡會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生。例如，當(dāng)免疫耐受機(jī)制增強(qiáng)時，促進(jìn)了癌癥的發(fā)生或外部感染原的侵襲，從而引發(fā)癌癥、傳染病等。反之，當(dāng)免疫應(yīng)答機(jī)制增強(qiáng)時，則可能發(fā)生炎性疾病諸如自身免疫性疾病、過敏。

2、最近，對免疫突觸的深入研究正在進(jìn)行，所述免疫突觸是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞之間或靶細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。免疫突觸由細(xì)胞分泌的各種細(xì)胞因子和信號遞質(zhì)，以及細(xì)胞表面表達(dá)的各種共刺激分子和受體組成。由于已經(jīng)報道了參與維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的各種因子，對通過靶向這些因子來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的免疫治療劑的興趣正在增加。迄今為止開發(fā)的大多數(shù)免疫治療劑是針對細(xì)胞因子或細(xì)胞表面分子的抗體藥物，但是由于功效不足或副作用，其用途非常有限。最近，為了更有效地治療免疫性疾病，正在開發(fā)使用了分化的免疫細(xì)胞諸如t細(xì)胞、nk細(xì)胞等的細(xì)胞治療劑或者能夠分化成各種免疫細(xì)胞的干細(xì)胞?；诜只拿庖呒?xì)胞的細(xì)胞治療劑諸如car-t或car-nk由于使用自體細(xì)胞而是昂貴的且具有有限的靶標(biāo)，而間充質(zhì)干細(xì)胞相對于治療成本具有低的治療效果且具有難以解釋清楚的作用機(jī)制的局限性(blood?cancer?j.11,69(2021)；world?j.stemcells.2019；11(4):212-221)。

3、同時，cd40配體(也稱為cd40l或cd154)是一種與抗原呈遞細(xì)胞的cd40結(jié)合的蛋白質(zhì)，并根據(jù)靶細(xì)胞表現(xiàn)出各種效應(yīng)(the?journal?of?experimental?medicine.175(4):1091–101)。cd40l通常有三個結(jié)合配偶體：cd40、α5β1整合素和αiibβ3。據(jù)報道，cd40l作為共刺激分子起作用，并且對于稱為t濾泡輔助細(xì)胞(tfh細(xì)胞)的t細(xì)胞亞群特別重要(journal?of?immunology.149(12):3817–26)。cd40l主要在激活的cd4+t細(xì)胞中表達(dá)，但也以可溶形式存在，并且據(jù)報道其不僅在t細(xì)胞中表達(dá)，還在血小板、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、nk細(xì)胞、b細(xì)胞和非造血細(xì)胞諸如內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞中表達(dá)(cellular?andmolecular?life?sciences.58(1):4–43)。cd40l被歸類為腫瘤壞死因子(tnf)超家族的成員，并且cd40/cd40l作為共刺激因子的信號傳導(dǎo)在t細(xì)胞激活和t細(xì)胞介導(dǎo)的b細(xì)胞分化和激活中起重要作用。此外，cd40/cd40l信號傳導(dǎo)的刺激在調(diào)控ox40/ox40l的表達(dá)和信號傳導(dǎo)機(jī)制中起重要作用，所述ox40/ox40l是同一類型的共刺激因子，因此參與t細(xì)胞的存活和記憶t細(xì)胞的發(fā)育。

4、在各種免疫穩(wěn)態(tài)相關(guān)疾病中，據(jù)報道cd40l在抗原呈遞細(xì)胞(apc)和t細(xì)胞之間的相互作用中起重要作用。特別地，cd40l/cd40相互作用在其中t細(xì)胞和b細(xì)胞的激活對病理學(xué)具有主要影響的自身免疫性疾病或炎性疾病中充當(dāng)致病因子。具體地說，它是各種疾病諸如1型糖尿病、甲狀腺炎、銀屑病、狼瘡(系統(tǒng)性紅斑狼瘡；sle)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、多發(fā)性硬化(ms)等的致病因子。靶向cd40l的各種化合物或抗體已被開發(fā)用于治療這些疾病(semin?immunol.2009；21(5):293-300；advanced?drug?delivery?reviews?volume?141,15february?2019,pages?92-103)。

5、由avacta開發(fā)的是一種基于stefin?a蛋白(一種體內(nèi)蛋白)而工程化的穩(wěn)定的小蛋白分子。包括具有隨機(jī)序列和n-末端序列的兩個短肽序列，并且能夠以類似于單克隆抗體的方式以高親和力和特異性與靶物質(zhì)結(jié)合。與游離肽文庫相比，顯示出顯著改善的結(jié)合親和力和特異性，并且與抗體相比，具有非常小的尺寸和高穩(wěn)定性，因此作為用于替代抗體的下一代替代藥物平臺而受到極大關(guān)注(美國專利號9447170、8853131等)。

6、在此背景下，本發(fā)明人已經(jīng)付出巨大努力通過工程化天然stefin?a蛋白開發(fā)了一種與cd40l特異性結(jié)合的多肽。結(jié)果，發(fā)明出了具有優(yōu)異親和力和特異性的與cd40l結(jié)合的stefin?a蛋白突變體。特別地，證實(shí)了與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體對cd40l表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的一個目的是提供與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體及其用途。

2、本發(fā)明的另一目的是提供包括所述與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體的融合蛋白。

3、本發(fā)明的又一目的是提供包括與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體的綴合物。

4、本發(fā)明的再一目的是提供編碼與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體或包括其的所述融合蛋白或所述綴合物的核酸，以及包含所述核酸的載體。

5、本發(fā)明的其他目的是提供其中導(dǎo)入了所述核酸和/或載體的基因工程化細(xì)胞及其用途。

6、為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體。

7、本發(fā)明還提供了包括與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體的融合蛋白。

8、本發(fā)明還提供了包括與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體的綴合物。

9、本發(fā)明還提供了編碼與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體或包含其的所述融合蛋白的核酸。

10、本發(fā)明還提供了包括所述核酸的遞送載體。

11、本發(fā)明還提供了導(dǎo)入了所述核酸的基因工程化細(xì)胞。

12、本發(fā)明還提供了所述基因工程化細(xì)胞用于制備stefin?a蛋白變體、所述融合蛋白或所述綴合物的用途。

13、本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體、所述融合蛋白或所述綴合物的方法，所述方法包括培養(yǎng)所述基因工程化細(xì)胞的步驟。

14、本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其包括與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體、所述融合蛋白、所述綴合物、所述核酸和/或所述遞送載體。

15、本發(fā)明還提供了與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體、所述融合蛋白、所述綴合物、所述核酸和/或所述遞送載體用于制備所述藥物組合物的用途。

16、本發(fā)明還提供了一種治療方法，其包括向受試者給藥與cd40l特異性結(jié)合的所述stefin?a蛋白變體、所述融合蛋白、所述綴合物、所述核酸和/或所述遞送載體。

17、本發(fā)明的與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體和/或包括其的融合蛋白或綴合物是非免疫原性多肽，其能夠以高親和力和特異性與cd40l結(jié)合，從而可用于靶向cd40l和多種已知表達(dá)cd40l的細(xì)胞。此外，本發(fā)明的與cd40l特異性結(jié)合的stefin?a蛋白變體表現(xiàn)出優(yōu)異的抑制cd40l活性的能力，因此可有效地用于預(yù)防和治療各種cd40l相關(guān)疾病的醫(yī)學(xué)/藥學(xué)目的。