本發(fā)明涉及一種用于制造腺相關(guān)病毒的生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種上述生產(chǎn)細(xì)胞的制造方法及使用了上述生產(chǎn)細(xì)胞的腺相關(guān)病毒的制造方法。

背景技術(shù)：

1、腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus(也稱(chēng)為aav))是屬于細(xì)小病毒科的直鏈單鏈dna病毒。野生型aav基因組包含復(fù)制的調(diào)節(jié)基因(rep基因)和衣殼的結(jié)構(gòu)基因(cap基因)，且為了病毒的復(fù)制和包裝相鄰有反向末端重復(fù)序列(itr)。aav載體能夠在增殖或非增殖的任一細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)?，尤其能夠在非分裂?xì)胞中進(jìn)行長(zhǎng)期的表達(dá)。并且，aav被認(rèn)為是非病原性，且免疫原性低。根據(jù)上述情況，aav載體作為基因治療用載體在臨床應(yīng)用上取得進(jìn)展。

2、aav為在腺病毒和皰疹病毒等輔助病毒的存在下增殖的非包膜病毒。在制備用于基因治療或核酸導(dǎo)入的aav時(shí)，典型的做法為使腺病毒與宿主細(xì)胞共感染而進(jìn)行了aav復(fù)制。并且，明確了負(fù)責(zé)腺病毒的輔助作用的基因，還使用攜帶有該基因的質(zhì)粒。例如，通過(guò)使包含rep基因及cap基因的質(zhì)粒、腺病毒輔助質(zhì)粒及包含目的基因(轉(zhuǎn)基因)的質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染為hek293細(xì)胞而能夠包裝成重組型aav(raav)。

3、在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中，記載使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生aav，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包含編碼在第1可抑制解除的啟動(dòng)子的控制下的病毒輔助基因的核酸分子、編碼在第2可抑制解除的啟動(dòng)子的控制下的aav基因的核酸分子及編碼第1及第2可抑制解除的啟動(dòng)子的阻遏要件的核酸分子。

4、在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中記載了一種宿主細(xì)胞，其包含對(duì)腺相關(guān)病毒rep蛋白質(zhì)rep78及rep蛋白質(zhì)rep68進(jìn)行編碼的核酸，其中，內(nèi)部aav啟動(dòng)子p19通過(guò)使維持rep78蛋白質(zhì)及rep68蛋白質(zhì)的功能性的一個(gè)以上的突變而被失活。

5、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

6、專(zhuān)利文獻(xiàn)

7、專(zhuān)利文獻(xiàn)1：國(guó)際公開(kāi)wo2020/132059號(hào)公報(bào)

8、專(zhuān)利文獻(xiàn)2：國(guó)際公開(kāi)wo2019/57691號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的技術(shù)課題

2、在專(zhuān)利文獻(xiàn)1的方法中，存在如下問(wèn)題：分別對(duì)aav產(chǎn)生中所需的輔助基因及aav基因附加控制序列，因此，通過(guò)3～5個(gè)控制序列之間的相互干涉而有可能存在針對(duì)每個(gè)對(duì)象基因充分地控制表達(dá)量變得困難。

3、并且，作為用于產(chǎn)生aav的方法的一例，有使用生產(chǎn)細(xì)胞的方法。在建立產(chǎn)生aav的生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)，存在產(chǎn)生細(xì)胞損傷的問(wèn)題。在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中，作為用于避免由rep蛋白質(zhì)引起的細(xì)胞毒性的方法，記載有使內(nèi)部aav啟動(dòng)子p19失活的方法，但沒(méi)有記載關(guān)于生產(chǎn)細(xì)胞的制造。

4、本發(fā)明的課題在于，提供一種用于避免或抑制了建立細(xì)胞株時(shí)的細(xì)胞損傷的aav產(chǎn)生的生產(chǎn)細(xì)胞。本發(fā)明的課題還在于，提供一種上述生產(chǎn)細(xì)胞的制造方法及使用了上述生產(chǎn)細(xì)胞的腺相關(guān)病毒的制造方法。

5、用于解決技術(shù)課題的手段

6、本發(fā)明人等為了解決上述課題而進(jìn)行了深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了通過(guò)不使用va-rna基因及e4基因中的至少一個(gè)而使用在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因來(lái)建立生產(chǎn)細(xì)胞，能夠避免或減少建立生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞損傷。本發(fā)明是基于上述見(jiàn)解而完成的。

7、根據(jù)本發(fā)明，提供以下發(fā)明。

8、<1>一種生產(chǎn)細(xì)胞，其不包含va-rna基因及e4基因中的至少一個(gè)且為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，

9、所述生產(chǎn)細(xì)胞在染色體中具有在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因和在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因。

10、<2>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，rep基因的外源啟動(dòng)子和cap基因的外源啟動(dòng)子為相同的啟動(dòng)子。

11、<3>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，rep基因存在于cap基因的轉(zhuǎn)錄方向的下游。

12、<4>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其在染色體中具有在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因，且不包含va-rna基因。

13、<5>根據(jù)<4>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e4基因位于ires的下游。

14、<6>根據(jù)<4>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e4基因的外源啟動(dòng)子為能夠進(jìn)行開(kāi)啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

15、<7>根據(jù)<6>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e4基因的外源啟動(dòng)子為能夠通過(guò)藥劑誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。

16、<8>根據(jù)<7>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e4基因的外源啟動(dòng)子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

17、<9>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其不包含va-rna基因及e4基因這兩者。

18、<10>根據(jù)<1>至<9>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其還包含e2a基因。

19、<11>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因位于ires的下游。

20、<12>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因在外源啟動(dòng)子的控制下。

21、<13>根據(jù)<12>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因在來(lái)源于巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子的控制下。

22、<14>根據(jù)<10>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因的外源啟動(dòng)子為能夠進(jìn)行開(kāi)啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

23、<15>根據(jù)<14>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因的外源啟動(dòng)子為能夠通過(guò)藥劑誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。

24、<16>根據(jù)<15>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，e2a基因的外源啟動(dòng)子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

25、<17>一種生產(chǎn)細(xì)胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，

26、所述生產(chǎn)細(xì)胞在染色體中具有在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因。

27、<18>根據(jù)<1>至<17>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其還包含目的基因。

28、<19>根據(jù)<1>至<18>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，cap基因的外源啟動(dòng)子及rep基因的外源啟動(dòng)子中的1個(gè)以上為能夠進(jìn)行開(kāi)啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

29、<20>根據(jù)<19>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，cap基因的外源啟動(dòng)子及rep基因的外源啟動(dòng)子中的1個(gè)以上為能夠通過(guò)藥劑誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。

30、<21>根據(jù)<20>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其包括：cap基因的外源啟動(dòng)子及rep基因的外源啟動(dòng)子中的1個(gè)以上位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

31、<22>根據(jù)<1>至<21>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其還包含在外源啟動(dòng)子的控制下的smallrep基因。

32、<23>根據(jù)<22>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，rep基因存在于smallrep基因的轉(zhuǎn)錄方向的下游。

33、<24>根據(jù)<22>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，smallrep基因的外源啟動(dòng)子為能夠進(jìn)行開(kāi)啟及關(guān)閉的切換的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

34、<25>根據(jù)<24>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，smallrep基因的外源啟動(dòng)子為能夠通過(guò)藥劑誘導(dǎo)表達(dá)的啟動(dòng)子。

35、<26>根據(jù)<25>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，smallrep基因的外源啟動(dòng)子位于四環(huán)素響應(yīng)因子的下游。

36、<27>根據(jù)<1>至<26>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其還包含表達(dá)反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子的基因。

37、<28>根據(jù)<27>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其包括：表達(dá)反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子的基因位于rep基因的下游。

38、<29>根據(jù)<1>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其包含在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的e2a基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的smallrep基因，

39、cap基因的外源啟動(dòng)子和e2基因的外源啟動(dòng)子為相同的啟動(dòng)子，rep基天的外源啟動(dòng)子和smallrep基因的外源啟動(dòng)子為相同的啟動(dòng)子。

40、<30>一種生產(chǎn)細(xì)胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，

41、所述生產(chǎn)細(xì)胞在染色體中具有在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的e2a基因，并且cap基因、rep基因及e2基因存在于附近，e4基因不存在于附近。

42、<31>一種生產(chǎn)細(xì)胞，其為不包含va-rna基因的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，

43、所述生產(chǎn)細(xì)胞在染色體中具有：

44、第一載體，攜帶有在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的e2a基因；及

45、第二載體，攜帶有在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因。

46、<32>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量比其他基因插入數(shù)量少。

47、<33>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量比cap基因或e2基因在染色體上的插入數(shù)量少。

48、<34>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量為cap基因在染色體上的插入數(shù)量的0.4倍以下。

49、<35>根據(jù)<31>或<32>所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中，染色體上的e4基因插入數(shù)量為e2基因在染色體上的插入數(shù)量的0.4倍以下。

50、<36>一種<1>至<35>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞的制造方法，其包括：將在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因?qū)氲讲溉閯?dòng)物細(xì)胞中。

51、<37>根據(jù)<36>所述的生產(chǎn)細(xì)胞的制造方法，其還包括導(dǎo)入反向四環(huán)素調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄激活因子。

52、<38>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括：通過(guò)培養(yǎng)<1>至<35>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

53、<39>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括如下工序：

54、在不誘導(dǎo)cap基因及rep基因的表達(dá)的條件下培養(yǎng)<1>至<35>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞而使上述生產(chǎn)細(xì)胞增殖；及

55、通過(guò)在誘導(dǎo)cap基因及rep基因的表達(dá)的條件下培養(yǎng)所增殖的生產(chǎn)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

56、<40>一種腺相關(guān)病毒的制造方法，其包括如下工序：

57、在不誘導(dǎo)cap基因、rep基因及e4基因的表達(dá)的條件下培養(yǎng)<4>至<8>中任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)細(xì)胞而使上述生產(chǎn)細(xì)胞增殖；及

58、通過(guò)在誘導(dǎo)cap基因、rep基因及e4基因的表達(dá)的條件下培養(yǎng)所增殖的生產(chǎn)細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生腺相關(guān)病毒。

59、<a>一種腺相關(guān)病毒，其通過(guò)<38>至<40>中任一項(xiàng)所述的腺相關(guān)病毒的制造方法來(lái)制造。

60、<b>一種用于制造生產(chǎn)細(xì)胞的載體試劑盒，其包括：第一載體，攜帶有在外源啟動(dòng)子的控制下的cap基因、在外源啟動(dòng)子的控制下的rep基因及在外源啟動(dòng)子的控制下的e2a基因；及第二載體，攜帶有在外源啟動(dòng)子的控制下的e4基因。

61、發(fā)明效果

62、根據(jù)本發(fā)明，能夠避免或減少建立生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞損傷。