本公開涉及用于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)黃體酮和/或熊去氧膽酸的遺傳改造的微生物。本公開還涉及用于生產(chǎn)4-膽酸-3-酮、3-酮基-石膽酸和石膽酸的遺傳改造的微生物。

背景技術(shù)：

1、黃體酮是一種在人體內(nèi)天然產(chǎn)生的類固醇，也是一種活性藥物成分(api)，通常用于女性激素替代療法。熊去氧膽酸是一種用于管理和治療膽汁淤積性肝病的藥物。目前大多數(shù)生產(chǎn)方法都采用需要刺激性化學(xué)品和溶劑的化學(xué)步驟。因此，生物合成和/或生物轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是一種具有高產(chǎn)率和較少化學(xué)廢物的替代方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開涉及改造的微生物細(xì)胞、微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物以及用于生產(chǎn)黃體酮和/或熊去氧膽酸(udca)的方法。本公開還涉及用于生產(chǎn)4-膽酸-3-酮、3-酮基-石膽酸和石膽酸的遺傳改造的微生物。

2、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生黃體酮的改造的微生物細(xì)胞，在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞表達(dá)：(a)非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶；和(b)一種或多種非原生狀態(tài)氧化還原伴侶蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種非原生狀態(tài)氧化還原伴侶蛋白包含非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白和/或非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶。在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與seq?id?nos:1-4和7-24中的任意一個(gè)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與seq?id?nos:5、25-37和137中的任意一個(gè)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與seq?id?no:6、38-46和136中的任何一個(gè)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶(例如，seq?id?no:18)或地下新鞘氨醇菌(novosphingobium?subterraneum)側(cè)鏈裂解p450酶(例如，seq?id?no:3)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

3、在某些實(shí)施方案中，(a)所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與細(xì)長(zhǎng)聚球藻(synechococcus?elongatus)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:33)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；并且所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與細(xì)長(zhǎng)聚球藻(synechococcus?elongatus)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:45)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；(b)所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:29)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；并且所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與細(xì)長(zhǎng)聚球藻(synechococcus?elongatus)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:43)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；或(c)所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:5)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列同一性；并且所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seqid?no:6)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

4、在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶(如seq?id?no:18)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:5)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:6)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性。

5、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含：編碼所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶的第一基因序列，以及編碼所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白或非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶的第二基因序列。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含：編碼所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶的第一基因序列、編碼所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含啟動(dòng)子(例如，組成型啟動(dòng)子)。在某些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是ptac或ppms。在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體進(jìn)一步包含所述第一基因序列、第二基因序列和/或第三基因序列上游的核糖體結(jié)合位點(diǎn)。

6、在某些實(shí)施方案中，所述第一基因序列、第二基因序列和第三基因序列中的兩個(gè)連接以表達(dá)融合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含與seq?id?no:54或55至少有80％、85％、90％、95％或100％同一性的連接肽序列。在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白包含與seq?id?no:47-53中任一項(xiàng)至少有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

7、在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體從5'端至3'端包含：(a)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還蛋白與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:5)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，(b)編碼非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶的第一基因序列，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶(例如，seq?id?no:18)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，和(c)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:6)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白和非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶通過(guò)具有seq?id?no:54所示序列的連接肽融合。

8、在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體從5'端至3'端包含：(a)編碼非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶的第一基因序列，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶(例如，seq?id?no:18)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，(b)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:5)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，和(c)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:6)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶和非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白通過(guò)具有seq?id?no:54所示序列的連接肽融合。

9、在某些實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體從5'端至3'端包含：(a)編碼非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶的第一基因序列，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶與新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶(例如，seq?id?no:18)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，(b)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:5)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，和(c)編碼非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列，所述非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白還原酶與菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:6)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性；在某些實(shí)施方案中，所述非原生狀態(tài)側(cè)鏈裂解p450酶和非原生狀態(tài)鐵氧化還原蛋白通過(guò)具有seq?id?no:55所示序列的連接肽融合。

10、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含一種或多種活性降低的參與植物甾醇降解的蛋白質(zhì)，在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與植物甾醇降解的蛋白質(zhì)選自類固醇c27-單加氧酶、細(xì)胞色素p450、3-酮類固醇-δ-1-脫氫酶和/或3-α、7-α、12-α-三羥基-5-β-膽固醇-24-烯?；?coa水合酶。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性通過(guò)以下一種或多種手段來(lái)實(shí)現(xiàn)：基因刪除(例如，基因敲除)、基因破壞、改變基因的調(diào)節(jié)、用活性較低的啟動(dòng)子替換原生啟動(dòng)子、隨機(jī)誘變、基于crispr的全基因組范圍的敲除，以及活性降低的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含一種或多種基因敲除，所述基因敲除包含：(a)smo3；(b)cyp142、smo3和smo1；(c)cyp142、smo3、smo2和kstd；(d)cyp142、smo3、smo2、chsh3和kstd；(e)cyp142、smo3、smo2和smo1；或(f)cyp142、smo3、smo2、smo1和smo4。

11、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞還表達(dá)膽固醇氧化酶、羥基類固醇脫氫酶和/或酮類固醇異構(gòu)酶。

12、一方面，本公開涉及一種培養(yǎng)本文所述的改造的微生物細(xì)胞的方法，該方法包括：在適合產(chǎn)生黃體酮的條件下(例如，在植物甾醇(例如，β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇和/或菜子甾醇)存在的情況下)培養(yǎng)所述細(xì)胞，任選地，在某些實(shí)施方案中，該方法還包括從培養(yǎng)物中回收黃體酮。

13、一方面，本公開內(nèi)容涉及一種產(chǎn)生4-膽酸-3-酮(4ca3o)、3-酮基-石膽酸(3-酮基-lca)、石膽酸(lca)和/或熊去氧膽酸(udca)的改造的微生物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含一種或多種活性降低的參與植物甾醇降解的蛋白質(zhì)，在某些實(shí)施方案中，所述降低活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與植物甾醇降解的蛋白質(zhì)包括?；?coa脫氫酶、3-α,7-α,12-α-三羥基-5-β-膽汁-24-烯?；?coa水合酶，和/或3-酮脂酰-acp還原酶。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性通過(guò)以下一種或多種手段來(lái)實(shí)現(xiàn)：基因刪除(例如，基因敲除)、基因破壞、改變基因的調(diào)節(jié)、用活性較低的啟動(dòng)子替換原生啟動(dòng)子、隨機(jī)誘變、基于crispr的全基因組范圍的敲除，以及活性降低的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞包含一種或多種基因敲除，所述基因敲除包含：(a)casc3；(b)chse3、chse1和chse2；(c)chse3、chse1、chse2和casc；(d)chse3、chse1、chse2和chsh3；(e)chse3、chse1、chse2和hsd4a；(f)chse3、chse1、chse2和casc3；(g)chse3、chse1、chse2、casc3和chsh3；(h)chse3、chse1、chse2、casc3、chsh3和chse5；(i)chse3、chse1、chse2、casc3、chsh3和chse4；或(j)chse3、chse1、chse2、casc3、chsh3、chse4和chse5。

14、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性增加的產(chǎn)生4-膽酸-3-酮(4ca3o)的上游酶。在某些實(shí)施方案中，所述增加活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞增加。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種上游酶包括硫酯酶。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)表達(dá)相對(duì)于原生酶具有增加的表達(dá)水平的酶或酶變體來(lái)增加一種或多種上游途徑酶的活性。

15、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性降低的參與4ca3o降解的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與4ca3o降解的蛋白質(zhì)選自?；?coa合成酶、?；?coa連接酶、?；?coa還原酶和醛還原酶。在某些實(shí)施方案中，編碼所述一種或多種參與4ca3o降解的蛋白質(zhì)的基因包含fadd17。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性降低的產(chǎn)生雄烯二酮、雄二烯二酮和/或雙降醇的上游酶。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種產(chǎn)生雄烯二酮、雄二烯二酮和/或雙降醇(例如，雄二烯二酮)的上游酶包括3-酮類固醇-δ-1-脫氫酶。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種產(chǎn)生雄烯二酮、雄二烯二酮和/或雙降醇的上游酶由kstd、chsh3、hsd4a和/或ltp2基因編碼。在某些實(shí)施方案中，本文所述的改造的微生物細(xì)胞包含一種或多種敲除，所述敲除包括：(a)chse3、chse1、chse2、casc3、kstd和chsh3；(b)chse3、chse1、chse2、casc3、kstd、chsh3和chse5；(c)chse3、chse1、chse2、casc3、kstd、chsh3、chse4和fadd17；或(d)chse3、chse1、chse2、casc3、kstd、chsh3、chse4、chse5和fadd17。

16、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性降低的參與lca和/或udca降解的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞降低。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與石膽酸(lca)和/或熊去氧膽酸(udca)降解的蛋白質(zhì)參與3α-羥基的氧化和5-碳位置的氧化以在lca和/或udca的4、5位置之間形成雙鍵；或參與udca的7β羥基的氧化、差向異構(gòu)化和脫羥基化。在某些實(shí)施方案中，所述降低的活性通過(guò)以下一種或多種手段來(lái)實(shí)現(xiàn)：基因刪除(例如，基因敲除)、基因破壞、改變基因的調(diào)節(jié)、用活性較低的啟動(dòng)子替換原生啟動(dòng)子、隨機(jī)誘變、基于crispr的全基因組范圍的敲除，以及活性降低的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)變體的表達(dá)。

17、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性增加的參與4ca3o向3-酮基-lca轉(zhuǎn)化的酶。在某些實(shí)施方案中，所述增加的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞增加。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與4ca3o向3-酮基-lca轉(zhuǎn)化的酶包括5β-類固醇還原酶(5βr)。在某些實(shí)施方案中，所述5βr是醉蝶花(tarenaya?hassleriana)5βr(例如，seq?id?no:77)或蘿卜(raphanus?sativus)5βr(例如，seq?id?no:95)。在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞還包含一種或多種活性增加的參與3-酮基-lca向lca轉(zhuǎn)化的酶，其中所述活性的增加是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞增加。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與3-酮基-lca轉(zhuǎn)化為lca的酶包括3α-羥基類固醇脫氫酶(3α-hsd)。在某些實(shí)施方案中，所述3α-hsd是伊格爾茲氏菌(eggerthella?sp.)3α-hsd(例如，seq?id?no:99)或活潑瘤胃球菌(ruminococcus?gnavus)3α-hsd(例如，seq?id?no:104)。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)表達(dá)相對(duì)于原生酶具有增加的表達(dá)水平的酶或酶變體來(lái)增加所述一種或多種參與4ca3o向3-酮基-lca轉(zhuǎn)化或3-酮基-lca向lca轉(zhuǎn)化的酶的活性。

18、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種活性增加的參與lca向udca轉(zhuǎn)化的酶。在某些實(shí)施方案中，所述增加的活性是指相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞增加。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種參與lca向udca轉(zhuǎn)化的酶包括7β-羥化酶和/或一種或多種氧化還原伴侶蛋白(例如，鐵氧化還原蛋白和鐵氧化還原蛋白還原酶，或細(xì)胞色素p450還原酶)。在某些實(shí)施方案中，所述7β-羥化酶是白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneriaalbata)7β-羥化酶(例如，seq?id?no:109)。在某些實(shí)施方案中，所述一種或多種氧化還原伴侶蛋白包含或來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白(例如，seq?id?no:137)和集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶(例如，seq?id?no:136)。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)表達(dá)相對(duì)于原生酶具有增加的表達(dá)水平的酶或酶變體來(lái)增加所述一種或多種參與lca向udca轉(zhuǎn)化的酶的活性。

19、在某些實(shí)施方案中，本文所述的改造的微生物細(xì)胞包含(a)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端依次包含或按任意順序包含編碼7β-羥化酶的第一基因序列、編碼鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；(b)第二表達(dá)載體，從5'端至3'端依次包含或按任意順序包含編碼5βr的第四基因序列和編碼3α-hsd的第五基因序列。在某些實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)載體和/或第二表達(dá)載體進(jìn)一步包含啟動(dòng)子(例如，pg13、psmo3或pksha)。在某些實(shí)施方案中，所述第一表達(dá)載體包含psmo3啟動(dòng)子，并且所述第二表達(dá)載體包含pksha或pg13啟動(dòng)子。

20、在某些實(shí)施方案中，本文所述的改造的微生物細(xì)胞包含：(a)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含psmo3啟動(dòng)子、編碼白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneria?albata)7β-羥化酶的第一基因序列、編碼集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶的鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；和第二表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含pksha啟動(dòng)子、編碼醉蝶花(tarenaya?hassleriana)5βr的第四基因序列和編碼伊格爾茲氏菌(eggerthella?sp.)3α-hsd的第五基因序列；(b)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含psmo3啟動(dòng)子、編碼白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneria?albata)7β-羥化酶的第一基因序列、編碼集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶的鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；和第二表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含pksha啟動(dòng)子、編碼醉蝶花(tarenaya?hassleriana)5βr的第四基因序列和編碼活潑瘤胃球菌(ruminococcus?gnavus)3α-hsd的第五基因序列；(c)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含psmo3啟動(dòng)子、編碼白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneria?albata)7β-羥化酶的第一基因序列、編碼集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶的鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；和第二表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含pg13啟動(dòng)子、編碼醉蝶花(tarenaya?hassleriana)5βr的第四基因序列和編碼伊格爾茲氏菌(eggerthella?sp.)3α-hsd的第五基因序列；(d)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含psmo3啟動(dòng)子、編碼白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneria?albata)7β-羥化酶的第一基因序列、編碼集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶的鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；和第二表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含pksha啟動(dòng)子、編碼蘿卜(raphanussativus)5βr的第四基因序列和編碼伊格爾茲氏菌(eggerthella?sp.)3α-hsd的第五基因序列；或(e)第一表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含psmo3啟動(dòng)子、編碼白色異庫(kù)茨涅爾氏菌(allokutzneria?albata)7β-羥化酶的第一基因序列、編碼集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白的第二基因序列，和編碼來(lái)源于集胞藻屬(synechocystis?sp.)鐵氧化還原蛋白還原酶的鐵氧化還原蛋白還原酶的第三基因序列；和第二表達(dá)載體，其從5'端至3'端包含pg13啟動(dòng)子、編碼醉蝶花(tarenaya?hassleriana)5βr的第四基因序列和編碼活潑瘤胃球菌(ruminococcus?gnavus)3α-hsd的第五基因序列。

21、一方面，本公開涉及一種培養(yǎng)本文所述的改造的微生物細(xì)胞的方法，該方法包括：在適合產(chǎn)生4ca3o、3-酮基-lca、lca和/或udca的條件下(例如，在植物甾醇(例如，β-谷甾醇、β-谷甾烷醇、菜油甾醇、豆甾醇和/或菜子甾醇)存在的情況下)培養(yǎng)所述細(xì)胞，任選地，其中該方法還包括從培養(yǎng)物中回收4ca3o、3-酮基-lca、lca和/或udca。

22、在某些實(shí)施方案中，所述改造的微生物細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞(例如，分枝桿菌(mycobacterium)屬物種)。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)菌細(xì)胞是新金分枝桿菌(mycobacterium?neoaurum)細(xì)胞(例如，新金分枝桿菌nrrl?b-3805)。

23、一方面，本公開涉及一種改造的微生物細(xì)胞的培養(yǎng)物，其包含本文所述的改造的微生物細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)物包含含量大于0.01毫克/升、0.05毫克/升、0.1毫克/升、0.5毫克/升、1毫克/升、5毫克/升、10毫克/升、50毫克/升、0.1克/升、0.2克/升、0.3克/升、0.4克/升、0.5克/升、0.6克/升、0.7克/升、0.8克/升、0.9克/升、1克/升、2克/升、3克/升、4克/升、5克/升、6克/升、7克/升、8克/升、9克/升、10克/升、15克/升、20克/升、25克/升、30克/升、35克/升、40克/升、45克/升、50克/升、55克/升、60克/升、65克/升、70克/升、75克/升、80克/升、85克/升、90克/升、95克/升或100克/升的黃體酮、4ca3o、3-酮基-lca、lca和/或udca。

24、一方面，本公開涉及一種生產(chǎn)孕烯醇酮和/或黃體酮的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與甾醇(例如，植物甾醇)接觸，從而生產(chǎn)孕烯醇酮和/或黃體酮。

25、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生孕烯醇酮和/或黃體酮的方法，該方法包括：使側(cè)鏈裂解p450酶與甾醇(例如，植物甾醇)接觸，從而產(chǎn)生孕烯醇酮和/或黃體酮。在某些實(shí)施方案中，所述側(cè)鏈裂解p450酶是表1中的任意一種側(cè)鏈裂解p450酶或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，本文所述的方法還包括：使鐵氧化還原蛋白和/或鐵氧化還原蛋白還原酶與側(cè)鏈裂解p450酶和甾醇(例如，植物甾醇)接觸。在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白是表2中任意一種鐵氧化還原蛋白或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白還原酶是表3中的任意一種鐵氧化還原蛋白還原酶或其衍生物。

26、一方面，本公開涉及一種生產(chǎn)3-酮基-石膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與4-膽酸-3-酮接觸，從而生產(chǎn)3-酮基-石膽酸。

27、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生3-酮基-石膽酸的方法，該方法包括：使5β-類固醇還原酶與4-膽酸-3-酮接觸，從而產(chǎn)生3-酮基-石膽酸。在某些實(shí)施方案中，所述5β-類固醇還原酶是表4中的任意一種5β-類固醇還原酶或其衍生物。

28、一方面，本公開涉及一種生產(chǎn)石膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與3-酮基-石膽酸接觸，從而產(chǎn)生石膽酸。

29、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生石膽酸的方法，該方法包括：使3α-羥基類固醇脫氫酶與3-酮基-石膽酸接觸，從而產(chǎn)生石膽酸。某些實(shí)施方案中，所述3α-羥基類固醇脫氫酶是表5中的任意一種3α-羥基類固醇脫氫酶或其衍生物。

30、一方面，本公開涉及一種生產(chǎn)石膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與4-膽酸-3-酮接觸，從而生產(chǎn)石膽酸。

31、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生石膽酸的方法，該方法包括：使5β-類固醇還原酶和3α-羥基類固醇脫氫酶與4-膽酸-3-酮接觸，從而產(chǎn)生石膽酸。在某些實(shí)施方案中，所述5β-類固醇還原酶是表4中的任意一種5β-類固醇還原酶或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述3α-羥基類固醇脫氫酶是表5中的任意一種3α-羥基類固醇脫氫酶或其衍生物。

32、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與石膽酸接觸，從而產(chǎn)生熊去氧膽酸。

33、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使7β-羥化酶與石膽酸接觸，從而產(chǎn)生熊去氧膽酸。在某些實(shí)施方案中，所述7β-羥化酶是表6中的任意一種7β-羥化酶中或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，本文所述的方法進(jìn)一步包括：使鐵氧化還原蛋白和/或鐵氧化還原蛋白還原酶與所述7β-羥化酶和石膽酸接觸。在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白是表2中的任意一種鐵氧化還原蛋白或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白還原酶是表3中的任意一種鐵氧化還原蛋白還原酶或其衍生物。

34、一方面，本公開涉及一種生產(chǎn)熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與3-酮基-石膽酸接觸，從而生產(chǎn)熊去氧膽酸。

35、一方面，本公開涉及產(chǎn)生熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使3α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥化酶與3-酮基-石膽酸接觸，從而產(chǎn)生熊去氧膽酸。在某些實(shí)施方案中，所述3α-羥基類固醇脫氫酶是表5中的任意一種3α-羥基類固醇脫氫酶或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述7β-羥化酶是表6中的任意一種7β-羥化酶或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，本文所述的方法進(jìn)一步包括：使鐵氧化還原蛋白和/或鐵氧化還原蛋白還原酶與3α-羥基類固醇脫氫酶、7β-羥化酶和3-酮基-石膽酸接觸。在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白表2中的任意一種鐵氧化還原蛋白或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白還原酶是表3中的任意一種鐵氧化還原蛋白還原酶或其衍生物。

36、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使本文所述的改造的微生物細(xì)胞或其細(xì)胞提取物與4-膽酸-3-酮接觸，從而產(chǎn)生熊去氧膽酸。

37、一方面，本公開涉及一種產(chǎn)生熊去氧膽酸的方法，該方法包括：使5β-類固醇還原酶、3α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥化酶與4-膽酸-3-酮接觸，從而產(chǎn)生熊去氧膽酸。在某些實(shí)施方案中，所述5β-類固醇還原酶是表4中的任意一種5β-類固醇還原酶或其衍生物，在某些實(shí)施方案中，所述3α-羥基類固醇脫氫酶是表5中的任意一種3α-羥基類固醇脫氫酶或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述7β-羥化酶是表6中的任意一種7β-羥化酶或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，本文所述的方法進(jìn)一步包括：使鐵氧化還原蛋白和/或鐵氧化還原蛋白還原酶與5β-類固醇還原酶、3α-羥基類固醇脫氫酶、7β-羥化酶和4-膽酸-3-酮接觸。在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白是表2中的任意一種鐵氧化還原蛋白或其衍生物，并且在某些實(shí)施方案中，所述鐵氧化還原蛋白還原酶是表3中的任意一種鐵氧化還原蛋白還原酶或其衍生物。

38、如本文所用，除非另有說(shuō)明，本公開中的酶(例如，側(cè)鏈裂解p450酶、鐵氧化還原蛋白、鐵氧化還原蛋白還原酶、脫氫酶等)包括野生型酶及其變體。變體可以與所述野生型酶具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列同一性，但是變體保留相似的功能或活性，或甚至可以具有改進(jìn)的功能或活性。例如，所述“側(cè)鏈裂解p450酶”催化膽固醇轉(zhuǎn)化為孕烯醇酮。術(shù)語(yǔ)“側(cè)鏈裂解p450酶”包括野生型側(cè)鏈裂解p450酶及其變體，其中所述變體具有基本相似或甚至更好的功能或活性。類似地，“鐵氧化還原蛋白”包括野生型鐵氧化還原蛋白及其變體，其中所述變體具有基本相似或甚至更好的功能或活性?！拌F氧化還原蛋白還原酶”包括野生型鐵氧化還原蛋白還原酶及其變體，其中所述變體具有基本相似或更好的功能或活性。同樣，新鞘氨醇菌屬(novosphingobium?sp.)pp1y側(cè)鏈裂解p450酶，地下新鞘氨醇菌(novosphingobiumsubterraneum)側(cè)鏈裂解p450酶、細(xì)長(zhǎng)聚球藻(synechococcus?elongatus)鐵氧化還原蛋白、細(xì)長(zhǎng)聚球藻(synechococcus?elongatus)鐵氧化還原蛋白還原酶、萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)鐵氧化還原蛋白、菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白、菠菜(spinacia?oleracea)鐵氧化還原蛋白還原酶、膽固醇氧化酶、羥基類固醇脫氫酶、酮類固醇異構(gòu)酶、硫酯酶、3α-羥基類固醇脫氫酶(3α-hsd)、5β-類固醇還原酶(5βr)、7β-羥化酶、細(xì)胞色素p450還原酶等包括野生型酶及其各自的變體。

39、除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。本文描述了用于本發(fā)明的方法和材料；也可以使用本領(lǐng)域已知的其他合適的方法和材料。所述材料、方法和實(shí)施例僅是說(shuō)明性的而非旨在限制。本文提及的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利、序列、數(shù)據(jù)庫(kù)條目和其他參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用將其全部?jī)?nèi)容并入本文。如有沖突，以本說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。

40、本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將從下面的詳細(xì)描述和附圖以及權(quán)利要求中闡述。