本公開涉及新的再合成試劑盒和方法，特別是用于成對測序。序列表本技術(shù)包含序列表，該序列表已以xml格式電子提交并且據(jù)此全文以引用方式并入。創(chuàng)建于2023年9月20日的該xml副本被命名為85491_08200_pct.xml并且大小為16.1千字節(jié)。

背景技術(shù)：

1、對生物樣品中存在的分析物(諸如核酸序列)的檢測已被用作鑒定和分類微生物、診斷傳染病、檢測和表征遺傳異常、鑒定與癌癥相關(guān)聯(lián)的遺傳變化、研究對疾病的遺傳易感性，以及測量對各種類型的治療的反應(yīng)的方法。用于檢測生物樣本中的分析物(諸如核酸序列)的常用技術(shù)是核酸測序。

2、生物分子研究的進展部分地由用于表征分子或其生物反應(yīng)的技術(shù)的改進引起。特別地，核酸dna和rna研究得益于對用于序列分析的技術(shù)的開發(fā)。

3、核酸擴增方法是已知的，該方法允許將擴增產(chǎn)物固定在固體載體上，以便形成由簇或“集落”組成的陣列，該簇或“集落”由多個相同的固定化多核苷酸鏈和多個相同的固定化互補鏈形成。根據(jù)這些方法制備的簇陣列上的dna集落中存在的核酸分子可提供用于測序反應(yīng)的模板。

4、用于對多核苷酸模板進行測序的一種方法涉及進行成對測序。這包括對模板的一條鏈進行測序(第一測序讀取，“讀取1”)，合成模板的互補形式(再合成)，并且然后對模板的互補形式進行測序(第二測序讀取，“讀取2”)。

5、雖然存在合成模板的互補形式的方法，但仍需要開發(fā)用于此類再合成的新試劑盒和方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、根據(jù)本公開的一個方面，提供了一種包含嗜熱磷酸酶和聚合酶的再合成試劑盒。

2、優(yōu)選地，試劑盒包含濃度為約0.01μm至約1000μm、約0.02μm至約100μm、約0.05μm至約50μm、約0.1μm至約20μm或約0.2μm至約10μm的嗜熱磷酸酶。

3、優(yōu)選地，嗜熱磷酸酶衍生自嗜熱菌，其中嗜熱菌屬于熱球菌(pyrococcus)屬。

4、優(yōu)選地，嗜熱磷酸酶包含seq?id?no:1所定義的氨基酸序列，或其功能性變體或功能性片段。

5、優(yōu)選地，嗜熱磷酸酶具有40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上、95℃以上、100℃以上、105℃以上或110℃以上的變性溫度。

6、優(yōu)選地，試劑盒包含濃度為約0.01μm至約1000μm、約0.02μm至約100μm、約0.05μm至約50μm、約0.1μm至約20μm或約0.2μm至約10μm的聚合酶。

7、優(yōu)選地，聚合酶是嗜熱聚合酶。

8、優(yōu)選地，嗜熱聚合酶具有40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上、95℃以上、100℃以上、105℃以上或110℃以上的變性溫度。

9、優(yōu)選地，試劑盒還包含嗜熱糖基化酶，優(yōu)選地嗜熱氧代鳥嘌呤糖基化酶。

10、優(yōu)選地，試劑盒包含濃度為約0.01μm至約1000μm、約0.02μm至約100μm、約0.05μm至約50μm、約0.1μm至約20μm或約0.2μm至約10μm的嗜熱糖基化酶。

11、優(yōu)選地，嗜熱糖基化酶衍生自嗜熱菌，其中嗜熱菌屬于甲烷球菌(methanocaldococcus，methanococcus)屬。

12、優(yōu)選地，嗜熱糖基化酶包含seq?id?no:2所定義的氨基酸序列，或其功能性變體或功能性片段。

13、優(yōu)選地，嗜熱糖基化酶具有40℃以上、45℃以上、50℃以上、55℃以上、60℃以上、65℃以上、70℃以上、75℃以上、80℃以上、85℃以上、90℃以上或95℃以上的變性溫度。

14、優(yōu)選地，試劑盒核酸外切酶，優(yōu)選地嗜熱核酸外切酶，優(yōu)選地嗜熱核酸外切酶。優(yōu)選地，試劑盒包含濃度介于約1ug/ml與1000ug/ml之間的嗜熱核酸外切酶。優(yōu)選地，嗜熱核酸外切酶衍生自深海熱球菌(pyrococcus?abyssi)或激烈熱球菌(pyrococcus?furiosus)。優(yōu)選地，嗜熱核酸外切酶包含seq?id?no:12所定義的氨基酸序列，或其功能性變體或功能性片段。優(yōu)選地，嗜熱核酸外切酶包含seq?id?no:13所定義的氨基酸序列，或其功能性變體或功能性片段。

15、優(yōu)選地，嗜熱磷酸酶在凍干制劑中。優(yōu)選地，凍干制劑包含嗜熱磷酸酶、鹽、核酸外切酶、去污劑以及氯化鎂、乙酸鎂或硫酸鎂中的任何一種或多種。優(yōu)選地，磷酸酶包括深海熱球菌堿性磷酸酶。

16、優(yōu)選地，嗜熱氧代鳥嘌呤糖基化酶在凍干制劑中。優(yōu)選地，凍干制劑包含嗜熱氧代鳥嘌呤糖基化酶、鹽和海藻糖。

17、優(yōu)選地，試劑盒包含選自由以下項組成的組中的至少一者：重組酶、單鏈核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸三磷酸(ntp)、產(chǎn)生atp的底物和產(chǎn)生atp的酶。

18、優(yōu)選地，試劑盒包含重組酶、單鏈核苷酸結(jié)合蛋白、核苷酸三磷酸(ntp)、產(chǎn)生atp的底物和產(chǎn)生atp的酶。

19、優(yōu)選地，試劑盒還包含金屬輔因子組合物，優(yōu)選地其中該金屬輔因子組合物包含鎂離子。

20、優(yōu)選地，試劑盒還包含在核酸模板的再合成或核酸模板的成對測序中使用試劑盒的說明書。

21、根據(jù)本公開的又一方面，提供了一種包含嗜熱糖基化酶和聚合酶的再合成試劑盒。優(yōu)選地，嗜熱糖基化酶如本文所述。優(yōu)選地，聚合酶如本文所述。

22、根據(jù)本公開的又一方面，提供了根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的再合成試劑盒在核酸模板的再合成或核酸序列的成對測序中的用途。

23、根據(jù)本公開的又一方面，提供了一種進行核苷酸序列的再合成的方法，其中該方法包括：使用嗜熱磷酸酶從封閉的引物去除封閉磷酸基團以形成解封閉的引物；以及使用聚合酶和第一核酸模板形成從解封閉的引物延伸的第二核酸模板。

24、優(yōu)選地，嗜熱磷酸酶如本文所定義。

25、優(yōu)選地，聚合酶如本文所定義。

26、優(yōu)選地，封閉的引物和/或解封閉的引物被固定在固體載體上，優(yōu)選地其中固體載體是流動池。

27、優(yōu)選地，形成從解封閉的引物延伸的第二核酸模板的步驟使用橋擴增進行。

28、優(yōu)選地，該方法還包括通過使用嗜熱糖基化酶分離第一核酸模板的步驟。

29、優(yōu)選地，嗜熱糖基化酶如本文所定義。

30、優(yōu)選地，該方法等溫進行。

31、優(yōu)選地，該方法在約50℃至約75℃、約55℃至約70℃或約60℃至約65℃的溫度下進行。

32、優(yōu)選地，該方法包括使用如本文所述的再合成試劑盒。

33、根據(jù)本公開的又一方面，提供了一種通過成對測序?qū)怂嵝蛄羞M行測序的方法，其中該方法包括：對第一核酸模板進行測序；使用如本文所述的方法進行核酸序列的再合成以形成第二核酸模板；以及對第二核酸模板進行測序。

34、優(yōu)選地，對第一核酸模板進行測序的步驟和/或?qū)Φ诙怂崮０暹M行測序的步驟使用合成測序技術(shù)或連接測序技術(shù)進行。

35、優(yōu)選地，該方法包括使用如本文所述的再合成試劑盒。