本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，并且更具體地，涉及可用于腫瘤的過繼性細(xì)胞免疫療法領(lǐng)域的抗體、t細(xì)胞受體和靶向ror1的免疫細(xì)胞。

背景技術(shù)：

1、免疫療法正在成為用于治療癌癥的非常有前景的方法。t細(xì)胞或t淋巴細(xì)胞(即免疫系統(tǒng)的武裝力量)不斷地尋找外來抗原，并將異常細(xì)胞(癌細(xì)胞或受感染的細(xì)胞)與正常細(xì)胞進(jìn)行區(qū)分。使用car(嵌合抗原受體)構(gòu)建體對t細(xì)胞或自然殺傷(nk)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾是用于設(shè)計(jì)腫瘤特異性t細(xì)胞和nk細(xì)胞的最常見方法?？梢詫邢蚰[瘤相關(guān)抗原(taa)的car-t細(xì)胞和car-nk細(xì)胞輸注到患者體內(nèi)(被稱為過繼性細(xì)胞轉(zhuǎn)移或act)，這是一種高效的免疫療法方法，參見grupp等人,(2013)針對急性淋巴細(xì)胞白血病的嵌合抗原受體修飾的t細(xì)胞(chimeric?antigen?receptor-modified?t?cells?for?acute?lymphoid?leukemia)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(n?engl?j?med)》368，1509-1518；以及maus等人,(2013).“表達(dá)嵌合抗原受體的t細(xì)胞可能引起人的過敏癥(t?cells?expressing?chimeric?antigen?receptorscan?cause?anaphylaxis?in?humans)”.《癌癥免疫學(xué)研究(cancer?immunol?res)》1,26-31。car-t(和car-nk)技術(shù)相較于化學(xué)療法或抗體的優(yōu)勢在于，經(jīng)工程化的細(xì)胞可以作為“活性藥物”在患者體內(nèi)增殖并持續(xù)存在。maus等人,(2014).抗體修飾的t細(xì)胞：car在血液惡性腫瘤中占領(lǐng)先地位(antibody-modified?t?cells:cars?take?the?front?seat?forhematologic?malignancies).《血液(blood)》123,2625-2635；以及goluboskaya等人,(2016)t細(xì)胞的不同亞群、記憶、效應(yīng)功能和car-t免疫療法(different?subsets?of?tcells,memory,effector?functions,and?car-t?immunotherapy).《癌癥(cancers)》(basel).2016年3月15日；8(3).pii:e36。

2、在n-c朝向上，car通常由單克隆抗體源性單鏈可變片段(scfv)、鉸鏈、跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)共激活結(jié)構(gòu)域(例如cd8、cd28、cd137(4-1bb)、cd27)以及一個(gè)或多個(gè)激活結(jié)構(gòu)域(例如cd3-ζ結(jié)構(gòu)域)組成，參見圖1和maus(2013)以及maus(2014)同上。car的進(jìn)化從第一代car(不具有共刺激結(jié)構(gòu)域)進(jìn)入到第二代car(具有一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域)，進(jìn)入到第三代car(具有若干個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域)。具有多個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域的第3代car的car-t細(xì)胞具有提高的溶細(xì)胞活性和改善的持久性，這使抗腫瘤活性增強(qiáng)。

3、自然殺傷細(xì)胞(nk)細(xì)胞是對先天免疫系統(tǒng)來說至關(guān)重要的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的類型。nk細(xì)胞發(fā)揮的作用類似于細(xì)胞毒性t細(xì)胞在脊椎動物適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用。nk細(xì)胞提供對病毒感染的細(xì)胞的快速應(yīng)答，在感染后3天左右起作用，并且對腫瘤形成作出應(yīng)答。

4、酪氨酸-蛋白激酶跨膜受體ror1(還被稱為神經(jīng)營養(yǎng)性酪氨酸激酶受體相關(guān)1(ntrkr1))是在人體中由ror1基因編碼的酶。ror1是受體酪氨酸激酶樣孤兒受體(ror)家族的成員。ror1是由937個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其中氨基酸30-406包括細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。ror1基因編碼受體酪氨酸激酶樣孤兒受體，所述受體酪氨酸激酶樣孤兒受體調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)突生長。ror1是屬于細(xì)胞表面受體的ror亞家族的糖基化的i型膜蛋白。ror1是配體wnt5a的受體，所述配體激活下游nfκb信號傳導(dǎo)通路并且可以產(chǎn)生對wnt介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的抑制。另外，最近表明，ror1在卵巢癌干細(xì)胞上表達(dá)，并促進(jìn)遷移、侵襲和癌癥干細(xì)胞球形成。ror1顯示出在血液癌和實(shí)體瘤中過表達(dá)，這使得其成為car-t療法的有用靶標(biāo)。

5、ror1顯示出在大多數(shù)正常人體組織中(如脂肪組織和軟組織、骨髓和免疫系統(tǒng)、內(nèi)分泌組織、女性組織、胃腸道、腎和膀胱、肝和膽囊、肺、肌肉、男性組織和皮膚等等)的表達(dá)低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是抗人ror1抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括具有與seqid?no:2至少90％相同的氨基酸序列的vh和具有與seq?id?no:3至少90％相同的氨基酸序列的vl。在一些實(shí)施例中，所述抗人ror1抗體或其抗原結(jié)合片段包括經(jīng)人源化的小鼠氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述抗原結(jié)合片段是單鏈可變片段(scfv)。在一些實(shí)施例中，所述scfv包括包含seq?id?no:17的vh、包含seq?id?no:18的vl以及接頭。在一些實(shí)施例中，所述scfv具有由seq?id?no:17組成的vh、由seq?id?no:18組成的vl以及接頭。在一些實(shí)施例中，所述scfv由包括seq?id?no:38的核酸編碼。在一些實(shí)施例中，所述scfv包括位于所述vh和所述vl中的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其中所述vh的cdr1包括序列tya，所述vh的cdr2包括seq?idno:41，所述vh的cdr3包括seq?id?no:42，所述vl的cdr1包括seq?id?no:43，所述vl的cdr2包括序列ran，并且所述vl的cdr3包括seq?id?no:45。

2、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是一種嵌合抗原受體(car)，其包括所述scfv并且進(jìn)一步包括：跨膜結(jié)構(gòu)域、至少一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域以及激活結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述共刺激結(jié)構(gòu)域是cd28和/或4-1bb。在一些實(shí)施例中，所述激活結(jié)構(gòu)域是cd3ζ。在一些實(shí)施例中，所述跨膜結(jié)構(gòu)域是cd8跨膜結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述car進(jìn)一步包括信號傳導(dǎo)肽和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述信號傳導(dǎo)肽和所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域是cd8信號傳導(dǎo)肽和cd8鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，所述car包括seq?id?no:19的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，所述car由seq?id?no:19的氨基酸序列組成。在一些實(shí)施例中，所述car由包括seq?id?no:39的序列的核酸編碼。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是一種表達(dá)seq?id?no:19的car的經(jīng)工程化的免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述細(xì)胞選自car-t細(xì)胞和car-nk(自然殺傷)細(xì)胞。

3、在一些實(shí)施例中，本發(fā)明是一種組合物，其包括表達(dá)seq?id?no:19的car的經(jīng)工程化的免疫細(xì)胞以及賦形劑。

技術(shù)特征：

1.一種抗人ror1抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括具有與seq?id?no:2至少90％相同的氨基酸序列的vh和具有與seq?id?no:3至少90％相同的氨基酸序列的vl。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人ror1抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括經(jīng)人源化的小鼠氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗人ror1抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段是單鏈可變片段(scfv)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的scfv，其包括包含seq?id?no:17的vh、包含seq?id?no:18的vl以及接頭。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的scfv，其包括由seq?id?no:17組成的vh、由seq?id?no:18組成的vl以及接頭。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的scfv，其由包括seq?id?no:38的核酸編碼。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的scfv，其包括位于所述vh和所述vl中的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，其中所述vh的cdr1包括序列tya，所述vh的cdr2包括seq?id?no:41，所述vh的cdr3包括seq?idno:42，所述vl的cdr1包括seq?id?no:43，所述vl的cdr2包括序列ran，并且所述vl的cdr3包括seq?id?no:45。

8.一種嵌合抗原受體(car)，其包括根據(jù)權(quán)利要求3所述的scfv并且進(jìn)一步包括：跨膜結(jié)構(gòu)域、至少一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域以及激活結(jié)構(gòu)域。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其中所述共刺激結(jié)構(gòu)域是cd28或4-1bb。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其中所述激活結(jié)構(gòu)域是cd3ζ。

11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其中所述跨膜結(jié)構(gòu)域是cd8跨膜結(jié)構(gòu)域。

12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其進(jìn)一步包括信號傳導(dǎo)肽和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的car，其中所述信號傳導(dǎo)肽和所述鉸鏈結(jié)構(gòu)域是cd8信號傳導(dǎo)肽和cd8鉸鏈結(jié)構(gòu)域。

14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其包括seq?id?no:19的氨基酸序列。

15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的car，其由seq?id?no:19的氨基酸序列組成。

16.根據(jù)權(quán)利要求8所述的car，其由包括seq?id?no:39的序列的核酸編碼。

17.一種經(jīng)工程化的免疫細(xì)胞，其表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求8所述的car。

18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的經(jīng)工程化的免疫細(xì)胞，其中所述權(quán)利要求選自car-t細(xì)胞和car-nk(自然殺傷)細(xì)胞。

19.一種組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求17所述的經(jīng)工程化的免疫細(xì)胞以及賦形劑。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種單克隆小鼠或經(jīng)人源化的ROR1抗體或單鏈可變片段(scFv)。本發(fā)明還涉及一種小鼠或經(jīng)人源化的ROR1嵌合抗原受體(CAR)，其從N末端到C末端包括：(i)本發(fā)明的單鏈可變片段(scFv)，(ii)跨膜結(jié)構(gòu)域，(iii)至少一個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域，以及(iv)激活結(jié)構(gòu)域。

技術(shù)研發(fā)人員：維塔·戈魯博夫斯卡婭,吳力軍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：卡里布生物科學(xué)公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2