發(fā)明領(lǐng)域本公開(kāi)涉及載脂蛋白e(apoe)模擬肽及其使用方法，特別是用于治療血脂異常或病毒感染。背景載脂蛋白e(apoe)通過(guò)作為低密度脂蛋白受體(ldlr)的配體，促進(jìn)肝臟清除富含甘油三酯的脂蛋白殘余物。此外，它含有幾個(gè)兩親性螺旋，可以介導(dǎo)膽固醇外流。apoe包括由鉸鏈區(qū)連接的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。n-末端結(jié)構(gòu)域包括四個(gè)α-螺旋。螺旋4負(fù)責(zé)與受體和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結(jié)合。c-末端結(jié)構(gòu)域包括與脂質(zhì)結(jié)合并通過(guò)abc?al轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)膽固醇外流的兩親性α-螺旋。只有脂質(zhì)結(jié)合的apoe以高親和力與ldl相關(guān)受體結(jié)合，因?yàn)槭荏w結(jié)合區(qū)域在無(wú)脂質(zhì)形式下被屏蔽。鑒于apoe的功能，許多apoe模擬肽已被設(shè)計(jì)為潛在的治療藥物。這些通常包括受體結(jié)合區(qū)和脂質(zhì)結(jié)合區(qū)(wolska等人，cells?10：597，2021)。雖然一些apoe模擬肽正處于早期臨床試驗(yàn)中，但仍然需要具有更好療效、安全性和其他特性的apoe模擬多肽。概述本文公開(kāi)了apoe模擬肽和包括apoe模擬肽的融合蛋白。在一些實(shí)例中,所公開(kāi)的肽和融合蛋白與之前的apoe模擬肽相比具有改進(jìn)的特性。在一些方面，apoe模擬肽的長(zhǎng)度為8-17個(gè)氨基酸，包括apoe的受體結(jié)合區(qū)(例如seq?id?no:34)或其部分，并包括連接該肽的至少兩個(gè)非連續(xù)氨基酸的一個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接。在一些實(shí)例中，該肽包括兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域，并且連接至少兩個(gè)不連續(xù)氨基酸的所述共價(jià)連接位于所述兩親性螺紋結(jié)構(gòu)域的疏水側(cè)的兩個(gè)氨基酸之間。一個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接可以是烴釘合(hydrocarbon?staple)、烴縫合(hydrocarbon?stitch)、內(nèi)酰胺橋或二硫鍵。在一些方面，共價(jià)連接是烴釘合(hydrocarbon?staple)、烴縫合(hydrocarbon?stitch)，包含(s)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(s5)、(s)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(s8)、雙戊烯基甘氨酸(b5)、(r)-α-甲基α-戊烯基甘氨酸(r5)和(r)-α-甲基α-辛烯基甘氨酸(r8)中的一個(gè)或更多個(gè)，或其任何組合。在一些方面，所公開(kāi)的apoe模擬肽包括一個(gè)或更多個(gè)額外的修飾。在一些實(shí)例中，所述修飾包括一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、添加或缺失；c-末端酰胺化；n-末端?；灰环N或更多種d-異構(gòu)體氨基酸；修飾的或非天然氨基酸；n-末端脂肪酸；c-末端脂肪酸；或其兩種或更多種的組合。在特定實(shí)例中，該肽在n-或c-末端包括辛酸或肉豆蔻酸修飾。在特定實(shí)例中，apoe模擬肽包含與seq?id?no:2-4、7-12、14-21和30-33中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者包含seq?id?no:2-4、7-12、14-21和30-33中任一個(gè)氨基酸序列或由其組成。在某些方面，apoe模擬肽結(jié)合脂蛋白(例如低密度脂蛋白(ldl)、中密度脂蛋白(idl)、高密度脂蛋白(hdl)和極低密度脂蛋白(vldl)、脂蛋白(a)(lp(a))、乳糜微粒和乳糜微粒殘留物中的一種或更多種)。在其他方面，apoe模擬肽與肝素或硫酸乙酰肝素蛋白多糖結(jié)合。還提供了包括所公開(kāi)的apoe模擬肽的融合蛋白，例如與第二肽共價(jià)連接的apoe模擬肽。在一些方面，融合蛋白包含與人新生兒fc受體(fcrn)igg結(jié)合位點(diǎn)或fcrn-白蛋白結(jié)合位點(diǎn)連接的公開(kāi)的apoe模擬肽。在一些實(shí)例中，融合蛋白包含與seq?id?no:22-25中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或者融合蛋白包含seq?id?no:22-25中任一個(gè)中的氨基酸序列或由其組成。還提供了包含一種或更多種公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在一些方面，該組合物配制用于靜脈內(nèi)施用、皮下施用或口服施用。本文提供了用公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白治療受試者的方法。在一些方面，該方法包括治療患有血脂異常的受試者，例如，通過(guò)向受試者施用有效量的公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白來(lái)降低受試者(如患有高甘油三酯血癥的受試者)的甘油三酯水平或降低受試者(如患有高膽固醇血癥的受試者)的膽固醇水平。在其他方面，該方法包括通過(guò)向受試者施用有效量的所公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白來(lái)治療受試者(例如患有β冠狀病毒感染，例如sars-cov-2感染的受試者)的病毒感染。在特定實(shí)例中，apoe模擬肽或融合蛋白被靜脈內(nèi)、皮下或口服施用于受試者。還提供了制備所公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白的方法。在某些方面，肽或融合蛋白是通過(guò)重組產(chǎn)生的，例如通過(guò)化學(xué)合成。還提供了減少樣品中脂蛋白的方法。在一些方面，該方法包括在足以使脂蛋白與一種或更多種肽結(jié)合的條件下，使含有脂蛋白的樣品與一種或者多種所公開(kāi)的apoe模擬肽接觸，從而形成肽/脂蛋白復(fù)合物，以及在足以使肽/脂蛋白蛋白復(fù)合物與糖胺聚糖結(jié)合的條件下使肽/脂肪蛋白復(fù)合物和糖胺聚糖(如硫酸葡聚糖、肝素或硫酸乙酰肝素)接觸，從而形成肽/脂肪酸/糖胺聚糖復(fù)合物。該方法還包括從樣品中去除肽/脂蛋白/糖胺聚糖復(fù)合物。在一些例子中，樣品是血漿，例如來(lái)自患有高膽固醇血癥受試者的血漿。通過(guò)參考附圖進(jìn)行的以下詳細(xì)描述，本公開(kāi)的上述和其他特征將變得更加明顯。附圖簡(jiǎn)述圖1是由apoe的受體結(jié)合區(qū)(seq?id?no:34)形成的陽(yáng)離子兩親性α螺旋的示意圖。圖2是apoe受體結(jié)合區(qū)的一部分的示例性烴釘合(stapled)apoe模擬肽(seq?idno:2)的示意圖。圖3是apoe受體結(jié)合區(qū)的示例性烴釘合(stapled)apoe模擬肽(seq?id?no:14)的示意圖。圖4是apoe受體結(jié)合區(qū)的示例性烴縫合(stitched)的apoe模擬肽(seq?id?no:15)的示意圖。圖5是具有n-末端肉豆蔻酸修飾的apoe氨基酸141-150的烴釘合(stapled)的apoe模擬肽(seq?id?no:29)的示意圖。圖6a和6b是顯示用所示肽處理的hepg2細(xì)胞中l(wèi)dl攝取的圖。圖7a和7b顯示用所示肽處理的hepg2細(xì)胞中vldl攝取(圖7a)和hdl攝取(圖7b)。圖8是顯示用所示肽處理的ldlr-ko?hepg2細(xì)胞中l(wèi)dl攝取的圖。圖9a-9c顯示用octac-e139-150(圖9a)或octa-n-e139-150(圖9b)處理的野生型和ldlr-ko?hepg2細(xì)胞中的ldl攝取。圖9c顯示由myrn-e139-150肽介導(dǎo)的ldlr-ko?hepg2細(xì)胞中的ldl攝取。圖10a和10b顯示用所示肽治療的小鼠的血漿總膽固醇(圖10a)和甘油三酯(圖10b)。時(shí)間為施用肽之前(預(yù)采血，prebleed)或施用肽之后1、3或6小時(shí)。*與對(duì)照組相比，p<0.01。圖11是顯示用所示apoe肽處理的hela?mcc1a細(xì)胞中小鼠肝炎病毒(mhv)gfp熒光減少的圖。圖12是所示肽在20℃、100μm水中的圓二色性(cd)光譜。圖13顯示未修飾肽與酰化釘合肽(acylated?stapled?peptides)對(duì)1,2,二肉豆蔻?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(dmpc)磷脂囊泡的增溶。圖14a和14b顯示野生型hepg2細(xì)胞在10μm肽存在下的ldl攝取(圖14a)和在5μm肽的存在下的vldl攝取(圖14b)。ac-he18a-nh2被納入作為對(duì)照(參見(jiàn)，例如，datta等人，biochemistry?39：213-220，2000)。圖15是顯示在所示肽和濃度存在下的細(xì)胞存活率的圖。圖16顯示ldl、myrn-e141-150-aml或預(yù)復(fù)合的ldl/myrn-e1?41-150-aml與肝素覆蓋的生物層干涉生物傳感器表面的結(jié)合。圖17顯示用ldl或ldl+myrn-e141-150-aml肽的肝素色譜。在基線時(shí)nacl濃度為0.15m，并施加了從0.15m到2m的線性梯度(由虛線顯示)。圖18a-18c顯示由octac-e139-150肽(圖18a和18b)或myrn-e141-150-aml肽(圖18c)介導(dǎo)的肝素酶處理的野生型hepg2細(xì)胞(圖18a與18c)或ldlr-ko?hepg2細(xì)胞的ldl攝取(圖18b)。圖19顯示在myrn-e141-150-aml肽存在的情況下，肝素對(duì)野生型hepg2細(xì)胞中l(wèi)dl攝取的影響。圖20a和20b顯示myrn-e139-150和octan-e139-150肽對(duì)apoe?ko小鼠血漿膽固醇(圖20a)和甘油三酯(圖20b)的影響。圖21a和21b顯示myrn-e141-150-aml(圖21a)和octan-e139-150(圖21b)肽對(duì)ldlr-ko小鼠血漿膽固醇的影響。序列表本文提供的任何核酸和氨基酸序列或所附的序列表使用核苷酸堿基和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫來(lái)顯示，如37c.f.r.§1.822中所定義。在至少一些情況下，僅顯示每個(gè)核酸序列的一條鏈，但是互補(bǔ)鏈被理解為通過(guò)對(duì)所顯示的鏈的任何引用而包括在內(nèi)。seq?id?no:1-21是示例性的apoe模擬肽。seq?id?no:22-25是示例性的apoe模擬肽融合蛋白。seq?id?no:26是示例性成熟人apoe蛋白的氨基酸序列：kveqavetepepelrqqtewqsgqrwelalgrfwdylrwvqtlseqvqeellssqvtqelralmdetmkelkaykseleeqltpvaeetrarlskelqaaqarlgadmedvcgrlvqyrgevqamlgqsteelrvrlashlrklrkrllrdaddlqkrlavyqagaregaerglsairerlgplveqgrvraatvgslagqplqeraqawgerlrarmeemgsrtrdrldevkeqvaevrakleeqaqqirlqaeafqarlkswfeplvedmqrqwaglvekvqaavgtsaapvpsdnhseq?id?no:27是示例性的人新生兒fc受體(fcrn)igg結(jié)合位點(diǎn)：rf(青霉胺)tghfg(n-甲基-甘氨酸)(n-甲基-亮氨酸)ypc-6-氨基己酸seq?id?no:28是示例性的人新生兒fc受體(fcrn)白蛋白結(jié)合位點(diǎn)：vmhcfwdeefkcdyg-6-氨基己酸seq?id?no:29是示例性肉豆蔻?；痑poe?141-150肽。seq?id?no:30-33是另外的示例性apoe模擬肽。seq?id?no:34是示例性apoe受體結(jié)合區(qū)(成熟人apoe蛋白的氨基酸134-150)：rvrlashlrklrkrllrseq?id?no:35是apoe受體結(jié)合區(qū)的一部分(成熟人apoe蛋白的氨基酸139-150)：shlrklrkrllrseq?id?no:36是apoe受體結(jié)合區(qū)的一部分(成熟人apoe蛋白的氨基酸141-150)：lrklrkrllrseq?id?no:37是apoe受體結(jié)合區(qū)的一部分(成熟人apoe蛋白的氨基酸141-148)：lrklrkrl詳細(xì)描述本文提供了apoe模擬肽。apoe肽通過(guò)螺旋的疏水側(cè)(也含有一個(gè)或更多個(gè)烴釘合(hydrocarbon?staples))和/或連接到n或c末端的酰基鏈與脂蛋白結(jié)合。同時(shí)，螺旋親水側(cè)的帶正電殘基與硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)和受體，如ldlr和可能的ldlr相關(guān)蛋白-1(lrp1)相互作用。在一些實(shí)例中，所公開(kāi)的肽提供優(yōu)于先前apoe模擬物(如wolska等人，cells?10:597，2021中描述的那些)的優(yōu)點(diǎn)。優(yōu)點(diǎn)包括以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：長(zhǎng)度更短、效力更強(qiáng)、與apoe的天然序列更相似、增加的蛋白水解抗性、增加的血漿半衰期和增加的口服生物利用度。如本文所述，所公開(kāi)的apoe模擬物降低apoe-ko小鼠的血漿總膽固醇和甘油三酯，也降低ldlr-ko小鼠的血漿總膽固醇。因此，它們可用于治療血脂異常病癥，如高膽固醇血癥或高甘油三酯血癥。此外，所公開(kāi)的肽減少了小鼠肝炎病毒，β冠狀病毒(如sars-cov-2)的原型的復(fù)制，證明了它們作為潛在抗病毒劑的有用性。i.術(shù)語(yǔ)除非另有說(shuō)明，技術(shù)術(shù)語(yǔ)均按慣例使用。分子生物學(xué)中許多常見(jiàn)術(shù)語(yǔ)的定義可以在krebs?et?al.(eds.),lewin’s?genes?xii,published?by?jones&bartlett?learning,2017中找到。如本文中所用，單數(shù)形式“a”、“an”和“the”既指單數(shù)也指復(fù)數(shù)，除非上下文另有明確說(shuō)明。例如，術(shù)語(yǔ)“肽”包括單數(shù)或復(fù)數(shù)肽，并且可被視為等同于短語(yǔ)“至少一種肽”。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“包含”表示“包括”。還應(yīng)理解的是，除非另有說(shuō)明，否則為核酸或多肽給出的任何和所有堿基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子質(zhì)量值都是近似值，并且是出于描述目的而提供的。盡管可以使用與本文所述的方法和材料類似或等同的許多方法和材料，但本文描述了特定合適的方法和材料。在沖突的情況下，將以本說(shuō)明書(包括術(shù)語(yǔ)解釋)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)施例僅是說(shuō)明性的而非旨在限制。為了便于審閱本公開(kāi)的各個(gè)方面，對(duì)特定術(shù)語(yǔ)提供如下解釋：烷基：指具有1至25個(gè)(c1-25)或更多碳原子的飽和脂肪族烴基，例如1至10個(gè)(c1-10)碳原子、1至4個(gè)(c1-4)碳原子，1至14個(gè)(c1-14)碳原子或2至22個(gè)(c2-22)碳原子或者6至18個(gè)(c6-18)碳原子。烷基部分可以被取代或未被取代。舉例來(lái)說(shuō)，該術(shù)語(yǔ)包括直鏈和支鏈烴基，如甲基(ch3)、乙基(-ch2ch3)、正丙基(-ch2ch2ch3)、異丙基(-ch(ch3)2)、正丁基(-ch2-ch2ch2ch3)、異丁基(-ch2ch2(ch3)2)、仲丁基(-ch(ch3)(ch2ch3))、叔丁基(-c(ch3)3)、正戊基(-ch2ch2ch2ch2ch3)、新戊基(-ch2c(ch3)3)、己基(c6h13)、庚基(c7h15)、辛基(c8h17)、癸基(c10h21)、十二烷基(c12h25)、十四烷基(c14h29)、十六烷基(c16h33)、十八烷基(c18h37)或二十烷基(c20h41)。兩親性：兩親性分子包含疏水(非極性)和親水(極性)基團(tuán)。兩親性分子的一個(gè)例子是兩親性肽。兩親性肽也可以被描述為螺旋肽，其在螺旋的一個(gè)面上具有親水性氨基酸殘基而在相反面上具有疏水性氨基酸殘基。在一些實(shí)例中，本文所描述的肽將在適當(dāng)條件下在體外或體內(nèi)形成兩親性螺旋。載脂蛋白e(apoe)：一種299個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，在清除富含甘油三酯的脂蛋白和膽固醇外流中發(fā)揮作用。apoe存在三種不同的亞型(apoe2、apoe3和apoe4)，它們?cè)诎被嵛恢?12和158處有所不同。apoe2與iii型高脂蛋白血癥相關(guān)，而apoe4是阿爾茨海默病的危險(xiǎn)因素。apoe突變與家族性異常β脂蛋白血癥或iii型高脂蛋白血癥有關(guān)，其特征是由于乳糜微粒和脂蛋白的清除受損，導(dǎo)致血漿膽固醇和甘油三酯升高。除非上下文另有明確說(shuō)明，否則術(shù)語(yǔ)apoe包括來(lái)自任何生物體的任何apoe基因、cdna、mrna或蛋白質(zhì)。apoe的核酸和蛋白質(zhì)序列可公開(kāi)獲得。例如，genbank登錄號(hào)nm_000041.4公開(kāi)了人apoe核酸序列，并且genbank注冊(cè)號(hào)np_000032.1公開(kāi)了人apoe蛋白序列，兩者都通過(guò)引用并入本文，如genbank于2022年5月5日提供的。在其他例子中，apoe包括蛋白質(zhì)的成熟(加工)形式，例如，缺乏信號(hào)序列。seq?id?no:26是示例性成熟人apoe蛋白的氨基酸序列。冠狀病毒：一個(gè)可以感染人類和非人類動(dòng)物的正鏈單鏈rna病毒大家族。冠狀病毒的名字來(lái)源于其表面的冠狀刺。病毒包膜由含有病毒膜(m)、包膜(e)和刺突(s)蛋白的脂質(zhì)雙層組成。大多數(shù)冠狀病毒會(huì)引起輕度至中度上呼吸道疾病，如普通感冒。β冠狀病毒是冠狀病毒的一個(gè)屬。已經(jīng)出現(xiàn)了三種可導(dǎo)致人類嚴(yán)重疾病和死亡的β冠狀病毒：嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒(sars-cov)、sar-cov-2和中東呼吸綜合征冠狀病毒(mers-cov)。其他感染人類的β冠狀病毒包括人類冠狀病毒hku1(hku1-cov)和人類冠狀病毒oc43(oc43-cov)。結(jié)構(gòu)域：蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)的一部分或片段，具有共同的結(jié)構(gòu)、理化和功能特征；例如，疏水性、極性、球狀、螺旋結(jié)構(gòu)域或特性，例如α螺旋結(jié)構(gòu)域，如兩親性螺旋結(jié)構(gòu)域；或受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如apoe的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)區(qū))。血脂異常病癥：與血液中任何或所有脂質(zhì)或脂蛋白含量改變相關(guān)的病癥。血脂異常病癥包括，例如，高脂血癥、高脂蛋白血癥、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、hdl缺乏癥、apoe缺乏癥、apoa-i缺乏癥和心血管疾病(如冠狀動(dòng)脈疾病、動(dòng)脈粥樣硬化和再狹窄)。家族性高膽固醇血癥(fh)：一種導(dǎo)致血漿ldl水平非常高的遺傳性病癥。fh影響大約每200-250人中的1人。ldlr的突變是fh的主要原因，ldlr是肝臟中負(fù)責(zé)ldl攝取的主要受體。影響ldlr功能的突變會(huì)導(dǎo)致循環(huán)中l(wèi)dl清除率降低。ldl水平極高的fh患者可能需要ldl單采術(shù)(ldl-apheresis)治療。融合：通過(guò)共價(jià)鍵連接。在一些實(shí)例中，“融合”是指通過(guò)重組方式將兩種多肽制成一個(gè)連續(xù)的多肽分子。例如，融合蛋白是包括連接在一起的兩個(gè)單獨(dú)多肽的蛋白質(zhì)。烴釘合(hydrocarbon?staple)或縫合(stitch)：肽中至少兩個(gè)部分之間的碳-碳鍵，在一些實(shí)例中，其穩(wěn)定了α螺旋結(jié)構(gòu)。烴釘合(hydrocarbon?staples)都是由α,α-二取代的非天然氨基酸形成的全烴交聯(lián)，包括末端烯烴鏈。在一些實(shí)例中，非天然氨基酸是不連續(xù)的，例如，被3或6個(gè)氨基酸隔開(kāi)。烴縫合(hydrocarbon?stitching)是指在中間位置形成具有共同附著點(diǎn)的兩個(gè)烴釘合(hydrocarbon?staples)(例如，使用三種非天然氨基酸形成兩個(gè)釘合(staples))?？捎糜谛纬蔁N釘合(hydrocarbon?staples)或縫合(stitches)的示例性非天然氨基酸包括(s)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(s5)、(s)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(s8)、(r)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(r5)，和(r)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(r8)，以任意組合。此外，雙戊烯基甘氨酸(b5)可用于形成烴縫合(hydrocarbon?stitches)，例如，允許形成兩個(gè)以b5為共同的附著點(diǎn)的釘合(見(jiàn)圖4中烴縫合(hydrocarbon?stitches)的示例)。例如，walensky和bird，j.med.chem.57:6275-6288，2014和hilinski等人，j.am.chem.soc.136:12314-12322，2014年。抑制或治療疾?。阂种萍膊?、病癥或病況的全面發(fā)展，例如，在有血脂異常病癥或病毒感染等疾病風(fēng)險(xiǎn)的受試者中。“治療”是指在疾病或病理狀況開(kāi)始發(fā)展后改善其體征或癥狀的治療干預(yù)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“改善”，關(guān)于疾病、病理狀況或癥狀，是指治療的任何可觀察到的有益效果。有益效果可以被證明，例如通過(guò)易感受試者中疾病臨床癥狀的延遲發(fā)作、疾病部分或全部臨床癥狀的嚴(yán)重程度減輕、疾病進(jìn)展減緩、疾病復(fù)發(fā)次數(shù)減少、受試者整體健康或福祉的改善，或通過(guò)特定疾病特有的其他參數(shù)。分離的：“分離的”生物成分(如核酸分子或蛋白質(zhì))是指從該成分所出現(xiàn)的環(huán)境中的其他生物成分(例如其他染色體和染色體外dna和rna、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器)基本上分離或純化的成分。已“分離”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白。該術(shù)語(yǔ)還包括通過(guò)在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸或蛋白質(zhì)。連接子或連接：通過(guò)共價(jià)鍵、或通過(guò)離子鍵、范德華鍵或氫鍵連接其他兩個(gè)分子的分子。在特定實(shí)例中，連接子包括烴釘合(hydrocarbon?staple)或烴縫合(hydrocarbonstitch)。在其他實(shí)例中，連接子是肽鍵。脂蛋白：含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的生化組合物，與蛋白質(zhì)結(jié)合，使脂肪能夠在細(xì)胞內(nèi)外的水中移動(dòng)。脂蛋白顆粒有五大類，按分子大小從大到小依次為乳糜微粒、極低密度脂蛋白(vldl)、中密度脂蛋白(idl)、低密度脂蛋白(ldl)和高密度脂蛋白(hdl)。hdl中蛋白質(zhì)與膽固醇的比例最高；其最豐富的載脂蛋白是apoa-i和apoa-ii。ldl含有載脂蛋白b，其核心由亞油酸酯組成，包括酯化和非酯化膽固醇分子。ldl顆粒的直徑約為22nm，質(zhì)量約為300萬(wàn)道爾頓。脂蛋白a(lp(a))是脂蛋白亞類；脂蛋白a由ldl樣顆粒和特定的載脂蛋白(a)(apo(a))組成，該載脂蛋白與ldl樣顆粒的載脂蛋白b共價(jià)結(jié)合。肽、多肽或蛋白質(zhì)：其中單體是通過(guò)例如酰胺鍵連接在一起的氨基酸殘基的聚合物。當(dāng)氨基酸是α-氨基酸時(shí)，可以使用l-光學(xué)異構(gòu)體或d-光學(xué)異構(gòu)體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“肽”或“多肽”或“蛋白質(zhì)”旨在涵蓋任何氨基酸序列并且包括修飾的序列。術(shù)語(yǔ)“肽”具體旨在用于涵蓋天然存在的肽以及重組或合成產(chǎn)生的肽。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”是指天然存在的α氨基酸、非天然α氨基酸、天然β氨基酸和非天然β氨基酸，以及修飾的氨基酸(例如，通過(guò)添加烴基基團(tuán)、羥基基團(tuán)、磷酸基團(tuán)、脂肪酸基團(tuán)、連接子或官能團(tuán)進(jìn)行修飾)。術(shù)語(yǔ)“殘基”或“氨基酸殘基”包括并入肽、多肽或蛋白質(zhì)中的氨基酸。非天然氨基酸包括但不限于4-羥基脯氨酸、鎖鏈素(desmosine)、γ-氨基丁酸、β-氰基丙氨酸、正纈氨酸、4-(r)-丁烯基-4(r)-甲基-n-甲基-l-蘇氨酸、n-甲基-l-亮氨酸、1-氨基-環(huán)丙烷甲酸、1-氨基-2-苯基-環(huán)丙烷甲酸、1-氨基-環(huán)丁烷甲酸、4-氨基-環(huán)戊烯甲酸、3-氨基-環(huán)己烷甲酸、4-哌啶基乙酸、4-氨基-1-甲基吡咯-2-羧酸、2,4-二氨基丁酸、2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨丁酸、2-氨基庚二酸、4-(氨基甲基)苯甲酸、4-氨基苯甲酸、鄰位、間位和對(duì)位取代的苯丙氨酸、二取代的苯丙氨酸、取代的酪氨酸和他汀類。此外，氨基酸可以被衍生化以包括羥基化、磷酸化、磺化、?；蛱腔陌被釟埢?。在一些方面，該修飾涉及用一種或更多種氨基酸取代具有相似理化和/或結(jié)構(gòu)特性的氨基酸(例如，“保守”取代)。保守取代的例子如下所示。保守取代通常保持(a)取代區(qū)域中肽骨架的結(jié)構(gòu)，例如，為螺旋構(gòu)象，(b)靶位點(diǎn)分子的電荷或疏水性，或(c)大部分側(cè)鏈。在其他方面，一個(gè)或更多個(gè)取代可以是非保守的，例如以下變化：其中(a)親水性殘基，例如絲氨?；蛱K?；〈杷詺埢?或被其取代)，例如亮氨?；?、異亮氨?；?、苯丙氨酰基、纈氨?；虮滨；?；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他殘基(或被其取代)；(c)具有正電性側(cè)鏈的殘基，例如賴氨酰基、精氨?；蚪M氨酸基，取代電負(fù)性殘基(或被其取代)，例如谷氨?；蛱於滨；?；或(d)具有大分子側(cè)鏈的殘基，例如苯丙氨酸，取代不具有側(cè)鏈的殘基(或被其取代)，例如，甘氨酸。藥學(xué)上可接受的載體：本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知可用于本公開(kāi)的藥學(xué)上可接收的載體。例如，remington:the?science?and?practice?of?pharmacy,adejare(ed.)academicpress,london,united?kingdom,23rd?edition(2021)，其描述了適用于本文公開(kāi)的肽的藥物遞送的組合物和制劑。一般而言，載體的性質(zhì)將取決于所采用的特定施用模式。例如，胃腸外制劑通常包括可注射流體，其包括藥學(xué)和生理學(xué)上可接受的流體，如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、右旋糖水溶液、甘油等作為載體。對(duì)于固體組合物(例如粉末、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規(guī)無(wú)毒固體載體可以包括，例如，藥用級(jí)甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體外，待施用的藥物組合物還可以含有少量無(wú)毒輔助物質(zhì)，例如潤(rùn)濕劑或乳化劑、防腐劑和ph緩沖劑等，例如乙酸鈉或山梨糖醇酐單月桂酸酯。磷脂：磷脂由一個(gè)水溶性極性頭部和兩個(gè)不溶于水的非極性尾部(通過(guò)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán))連接組成。兩個(gè)尾部都由脂肪酸組成，每個(gè)尾部約14至約24個(gè)碳基團(tuán)長(zhǎng)。當(dāng)置于水性環(huán)境中時(shí)，磷脂形成雙層或膠束，疏水尾部相對(duì)排列。這形成了一個(gè)兩側(cè)都有親水頭的膜。在一些例子中，磷脂是一種脂質(zhì)，是動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分。純化：術(shù)語(yǔ)純化不需要絕對(duì)純度；相反，它是一個(gè)相對(duì)的術(shù)語(yǔ)。因此，例如，純化的化合物制劑是其中化合物比在其生成環(huán)境中更富集的制劑，例如在細(xì)胞內(nèi)或生化反應(yīng)室中。在一些方面，化合物制劑被純化以使得化合物占制劑含量的至少50％。重組：重組核酸或蛋白質(zhì)是指具有非天然的序列或由兩個(gè)分離的序列片段人工組合而成的序列。這種人工組合可以通過(guò)化學(xué)合成或通過(guò)人工操縱分離的核酸片段來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如通過(guò)基因工程技術(shù)。在一些實(shí)例中，重組蛋白是由重組核酸分子編碼的蛋白。受試者：活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物，這一類別包括人、獸醫(yī)學(xué)和實(shí)驗(yàn)室受試者，包括人和非人哺乳動(dòng)物。治療有效量：指定試劑(或試劑組合)的量，足以在用該試劑治療的受試者中實(shí)現(xiàn)所需效果，例如，足以預(yù)防、治療、減少和/或改善病癥或疾病的癥狀和/或根本病因的量。在某些方面，“有效量”是指足以降低受試者血漿膽固醇和/或甘油三酯水平和/或治療或抑制血脂異常病癥或病毒感染的量。ii.apoe模擬肽本文公開(kāi)了apoe模擬肽。該肽包括全部或部分的apoe受體結(jié)合區(qū)，長(zhǎng)度為8-17個(gè)氨基酸，并包括連接該肽的至少兩個(gè)非連續(xù)氨基酸的一個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接。在一些方面，apoe模擬肽增加細(xì)胞脂蛋白攝取，降低受試者的血清甘油三酯水平，降低受試者的血清總膽固醇水平，或其兩種或多種的組合。所公開(kāi)的apoe模擬肽包括apoe的受體結(jié)合區(qū)(例如，seq?id?no:34)、修飾的apoe受體結(jié)合區(qū)(例如，seq?id?no:34的氨基酸序列，其中一個(gè)或更多個(gè)氨基酸被非天然氨基酸取代)或其部分。在一些方面，肽的長(zhǎng)度為8至17個(gè)氨基酸(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)氨基酸長(zhǎng))。在特定實(shí)例中，肽的長(zhǎng)度為8、10、12或17個(gè)氨基酸。在一些方面，肽的長(zhǎng)度為17個(gè)氨基酸并且包括seq?id?no:34的氨基酸或其修飾形式。在其他方面，該肽的長(zhǎng)度為12個(gè)氨基酸并且包括seq?id?no:35或其修飾形式。在另外的方面，該肽的長(zhǎng)度為10個(gè)氨基酸并且包括seq?id?no:36的氨基酸或其修飾形式。在另外的方面，該肽的長(zhǎng)度為8個(gè)氨基酸并且包括seq?id?no:37的氨基酸或其修飾形式。在任何公開(kāi)的肽中，序列中的一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、4或更多個(gè))氨基酸可以被能夠形成烴釘合(hydrocarbon?staple)或縫合(stitch)的非天然氨基酸取代。肽包括肽中兩個(gè)不連續(xù)氨基酸之間的一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3或4個(gè))共價(jià)連接。在一些方面，肽包括肽中一對(duì)不連續(xù)氨基酸之間的一個(gè)共價(jià)連接。在其他方面，肽包括兩個(gè)共價(jià)連接，每個(gè)共價(jià)連接位于肽中兩對(duì)不同的不連續(xù)氨基酸之一之間。在又進(jìn)一步的方面，該肽包括肽中三個(gè)不連續(xù)氨基酸之間的兩個(gè)共價(jià)連接，其中一個(gè)不連續(xù)的氨基酸與另外兩個(gè)不連續(xù)的氨基酸中的每一個(gè)具有共價(jià)連接。在一些方面，共價(jià)連接是烴釘合(hydrocarbon?staple)、烴縫合(hydrocarbon?stitch)、二硫鍵或內(nèi)酰胺橋(例如，由賴氨酸ε-氨基與谷氨酸或天冬氨酸側(cè)基羧基環(huán)化形成)，或其他穩(wěn)定螺旋形成的化學(xué)鍵。當(dāng)存在兩個(gè)或多個(gè)共價(jià)連接時(shí)，共價(jià)連接可以是相同的或不同的共價(jià)連接。在一些具體實(shí)例中，所公開(kāi)的肽包括一個(gè)烴釘合(hydrocarbon?staple)、兩個(gè)烴釘合(hydrocarbon?staple)、一個(gè)烴縫合(hydrocarbon?stitch)(包括兩個(gè)烴縫合)或一個(gè)烴釘合(hydrocarbon?staple)和一個(gè)內(nèi)酰胺橋。在一些實(shí)例中，共價(jià)連接為肽提供了一種或更多種改進(jìn)的性質(zhì)，包括α螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、與脂蛋白結(jié)合的改善和對(duì)蛋白水解的抗性中的一種或幾種。在具體方面，所公開(kāi)的肽包括一種或更多種烴釘合(hydrocarbon?staple)或烴縫合(hydrocarbon?stitch)。烴釘合(hydrocarbon?staple)是兩個(gè)部分之間形成的全烴交聯(lián)，如包括末端烯烴鏈的α，α-二取代的非天然氨基酸。烴縫合(hydrocarbon?stitch)由兩個(gè)在中間位置具有共同附著點(diǎn)的烴釘合(hydrocarbon?staple)組成。因此，在一些實(shí)例中，apoe肽中的至少兩個(gè)(例如至少2、3、4或更多個(gè))非連續(xù)氨基酸被非天然氨基酸取代，該非天然氨基酸在連接時(shí)能夠形成烴釘合(hydrocarbon?staple)。在一些實(shí)例中，非連續(xù)氨基酸由3或6個(gè)氨基酸分隔?？捎糜谛纬蔁N釘合(hydrocarbon?staples)或縫合(stitches)的示例性非天然氨基酸包括(s)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(s5)、(s)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(s8)、(r)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸(r5)、(r)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸(r8)、雙-戊烯基甘氨酸(b5)、(s)-戊烯基丙氨酸、(s)-辛烯基丙氨酸、(r)-戊烯基丙氨酸和(r)-辛烯基丙氨酸，其任意組合。在一些實(shí)例中，選擇非天然氨基酸，使其能夠形成烴釘合(hydrocarbon?staple)。因此，例如，如果兩個(gè)非天然氨基酸被2或3個(gè)氨基酸隔開(kāi)，則烴釘合(hydrocarbon?staple)是“短”的，并且連接是在兩個(gè)戊烯基修飾的氨基酸之間(例如s5和s5之間、r5和r5之間、s5和r5之間或r5和s5之間)。如果兩個(gè)非天然氨基酸被6個(gè)氨基酸隔開(kāi)，則烴釘合(hydrocarbonstaple)是“長(zhǎng)”的，連接是在戊基修飾的氨基酸和辛烯基修飾的氨基酸之間(例如r8和s5之間或s8和r5之間)。在其他實(shí)例中，選擇非天然氨基酸使其能夠形成烴縫合(hydrocarbonstitch)。在一個(gè)具體實(shí)例中，烴縫合(hydrocarbon?stitch)的形成包括辛烯基修飾的氨基酸與雙戊烯基甘氨酸殘基隔開(kāi)6個(gè)氨基酸，其又與戊烯基修飾氨基酸隔開(kāi)3個(gè)氨基酸(如r8-b5-r5、r8-b5-s5、s8-b5-s5或s8-b5-r5)。在其他實(shí)例中，烴縫合(hydrocarbon?stitch)的形成包括戊炔基修飾的氨基酸與雙戊烯基甘氨酸殘基隔開(kāi)3個(gè)氨基酸，其又與辛烯基修飾氨基酸隔開(kāi)6個(gè)氨基酸(如s5-b5-s8、s5-b5-r8、r5-b5-r8或r5-b5-s8)。在另一個(gè)實(shí)例中，烴縫合(hydrocarbon?stitch)的形成包括辛烯基修飾的氨基酸與雙戊烯基甘氨酸殘基隔開(kāi)6個(gè)氨基酸，其又與第二個(gè)辛烯基修飾的氨基酸隔開(kāi)6個(gè)氨基酸(如r8-b5-s8、s8-b5-r8、r8-b5-r8或s8-b5-s8)。在另一個(gè)例子中，烴縫合(hydrocarbon?stitch)的形成包括戊炔基修飾的氨基酸與雙戊烯基甘氨酸殘基隔開(kāi)3個(gè)氨基酸，其又與戊炔基修飾的氨基酸隔開(kāi)3個(gè)氨基酸(如r5-b5-s5、r5-b5-r5、s5-b5-r5或s5-b5-s5)。本公開(kāi)內(nèi)容還涵蓋除上述共價(jià)連接以及產(chǎn)生這種連接所需的任何修飾之外的一種或更多種額外的修飾的肽。在一些方面，肽包括一種或更多種修飾，包括與天然存在的apoe氨基酸序列相比，或與非天然存在的氨基酸相比，用另一種天然存在的氨基殘基對(duì)apoe模擬肽中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸進(jìn)行添加、缺失和/或取代。在一些實(shí)例中，亮氨酸(例如對(duì)應(yīng)于seq?id?no:26的亮氨酸149的亮氨酸)可以用α-甲基-亮氨酸、n-甲基-亮氨酸或β-亮氨酸代替。在其他實(shí)例中，精氨酸(例如對(duì)應(yīng)于seq?id?no:26的精氨酸150的精氨酸)可以用高精氨酸取代。在進(jìn)一步的實(shí)例中，肽中的一個(gè)或更多個(gè)賴氨酸殘基可以用精氨酸或高精氨酸取代。在一些實(shí)例中，取代可以使肽更能抵抗蛋白水解，增加血漿半衰期，增加生物利用度，或其兩種或多種的組合。除了天然存在的基因編碼氨基酸之外，所公開(kāi)的肽中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基可以被天然存在的非編碼氨基酸和/或合成氨基酸取代。在一些方面，取代可以增加脂質(zhì)結(jié)合，增加對(duì)蛋白水解的抗性，增加口服生物利用度，或其組合。在一些實(shí)例中，此類氨基酸包括賴氨酸ε-氨基的酰化；精氨酸、組氨酸或賴氨酸的n-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧基的烷基化；谷氨酰胺或天冬酰胺的脫酰胺；β-丙氨酸和其他omega-氨基酸，例如3-氨基丙酸、2,3-二氨基丙酸、4-氨基丁酸等；α-氨基異丁酸；ε-氨基己酸；δ-氨基戊酸；n-甲基甘氨酸或肌氨酸；鳥(niǎo)氨酸；瓜氨酸；青霉胺；叔丁基丙氨酸；叔丁基甘氨酸；n-甲基異亮氨酸；苯基甘氨酸；環(huán)己基丙氨酸；正亮氨酸；萘丙氨酸；4-氯苯丙氨酸；2-氟苯丙氨酸；3-氟苯丙氨酸；4-氟苯丙氨酸；α-甲基-亮氨酸；n-甲基-亮氨酸；β-亮氨酸；1,2,3,4-四氫異喹啉-3-羧酸；β-2-噻吩基丙氨酸；蛋氨酸亞砜；高精氨酸；n-乙酰基賴氨酸；α-甲基-賴氨酸；2,4-二氨基丁酸；2,3-二氨基丁酸；對(duì)氨基苯丙氨酸；n-甲基纈氨酸；同型半胱氨酸；高苯丙氨酸；高絲氨酸；羥脯氨酸；高脯氨酸；n-甲基化氨基酸；類肽(其中側(cè)鏈基團(tuán)附著在肽骨架的氮原子上，而不是附著在α-碳上)；以及β-肽(其中氨基與β碳而不是α碳結(jié)合)。在一個(gè)具體實(shí)例中，肽中的一個(gè)或更多個(gè)亮氨酸殘基(例如對(duì)應(yīng)于seq?id?no:26的氨基酸149的亮氨酸)被α-甲基-亮氨酸或n-甲基-亮氨酸取代。雖然在某些方面，所公開(kāi)的apoe模擬肽的氨基酸是l-氨基酸，但在其他方面，一個(gè)或更多個(gè)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個(gè)，或全部)l-氨基酸被d-氨基酸取代(例如l-leu→d-leu)。在一些實(shí)例中，包括一種或更多種d-氨基酸可以使肽對(duì)蛋白水解更具抗性，增加血漿半衰期，和/或增加口服生物利用度。在一些方面，肽中的所有氨基酸都是d-氨基酸。在其他方面，一個(gè)或更多個(gè)氨基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個(gè))是d-氨基酸。在一些實(shí)例中，l-lys變?yōu)閐-arg或d-高精氨酸，或者l-arg變?yōu)閐-lys或d-高精氨酸。在一些實(shí)例中，至少1、2或3個(gè)c-末端氨基酸是d-氨基酸。具體的非限制性實(shí)例包括seqid?no:7-10、32和33中任一個(gè)的肽。在另外的實(shí)例中，修飾或非天然存在的氨基酸、非編碼氨基酸或合成氨基酸(例如上文所描述的那些)可以是d-氨基酸。在進(jìn)一步的方面，所公開(kāi)的肽可以包括n-末端修飾、c-末端修飾或兩者。在一些實(shí)例中，肽包括n-末端?；-末端酰胺化或兩者。在其他實(shí)例中，該修飾包括n-末端或c-末端脂肪酸，例如，以增加肽與脂蛋白的結(jié)合。在一些實(shí)例中，脂肪酸是c6-c18脂肪酸(從己酸到硬脂酸)。在具體實(shí)例中，脂肪酸是辛酸(也稱為辛酸)或肉豆蔻酸。在其他實(shí)例中，n-末端修飾包括脫氨基、n-低級(jí)烷基、n-二-低級(jí)烷基、受約束烷基(例如支鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)和n-?；揎棥Ｊ纠缘腸末端修飾包括酰胺、低級(jí)烷基酰胺、受約束烷基(例如支鏈、環(huán)狀、稠合、金剛烷基)烷基、二烷基酰胺和低級(jí)烷基酯修飾。低級(jí)烷基是c1-c4烷基。在一些方面，所公開(kāi)的apoe模擬肽包括與seq?id?no:2-4、7-12、14-21和30-33中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列。在其他實(shí)例中，apoe模擬肽的氨基酸序列包括seq?id?no:2-4、7-12、14-21和30-33中任一個(gè)的氨基酸序列或由其組成。表1中提供了示例性的烴釘合(hydrocarbon?stapled)或縫合(stitched)的apoe模擬肽。表1.示例性apoe肽ac:n-末端酰化nh2：c-末端酰胺化s5：(s)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸r8：(r)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸s8：(s)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸r5：(r)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸b5：雙戊烯基甘氨酸小寫表示d-氨基酸還提供了融合蛋白，其包括與另外的肽連接或融合的公開(kāi)的apoe模擬肽。在一些方面，apoe模擬肽與可以提高口服生物利用度和/或增加肽血漿半衰期的肽或修飾肽連接。額外的肽可以融合到apoe模擬肽的n-末端或apoe模擬多肽的c-末端。在一些方面，apoe模擬肽和另外的肽是連續(xù)的(例如，直接連接)。在其他方面，apoe模擬肽和附加肽通過(guò)接頭連接，例如肽接頭。在一些實(shí)例中，肽接頭為1、2、3、4或更多個(gè)氨基酸長(zhǎng)，例如1-3個(gè)甘氨酸殘基或脯氨酸殘基。在其他實(shí)例中，接頭是雙功能接頭(例如琥珀酰亞胺)、二硫鍵、6-氨基己酸或非編碼氨基酸，例如異氨基丁酸。igg和白蛋白具有極長(zhǎng)的血漿半衰期，而大多數(shù)其他人類蛋白質(zhì)則表現(xiàn)出快速的血液清除率。igg和白蛋白的這種長(zhǎng)半衰期是與新生兒fc受體(fcrn)相互作用的結(jié)果，fc受體形成細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)庫(kù)，防止溶酶體降解并且隨后再循環(huán)到細(xì)胞外空間。治療性蛋白質(zhì)與igg的fc結(jié)構(gòu)域、白蛋白或長(zhǎng)而靈活的多肽延伸之間的基因融合已被引入以延長(zhǎng)蛋白質(zhì)循環(huán)。fcrn在ph?6時(shí)可以結(jié)合igg，但在生理ph(7.4)時(shí)不能結(jié)合，這種ph依賴性可能是fcrn延長(zhǎng)igg半衰期的機(jī)制的關(guān)鍵。認(rèn)為在將igg攝取到細(xì)胞中后，fcrn可以與酸性內(nèi)體中的igg結(jié)合，從而避免溶酶體中的降解。igg分子隨后通過(guò)胞吐作用返回細(xì)胞表面并釋放回循環(huán)，因?yàn)閒crn在細(xì)胞外ph?7.4時(shí)對(duì)igg的親和力最小。在一些實(shí)例中，apoe模擬肽連接至人新生兒fc受體(fcrn)結(jié)合序列，例如igg結(jié)合位點(diǎn)(例如seq?id?no:27)、白蛋白結(jié)合位點(diǎn)(如seq?id?no:28)或非igg/非白蛋白fcrn結(jié)合位點(diǎn)。例如，參見(jiàn)美國(guó)專利no?9,527,890；9,012,603；9,574,190；10,046,023；10,316,073；10,588,935；mezoet?al.，proc.natl.acad.sci.usa105:2337-2342，2008。融合蛋白可以包括上文討論的關(guān)于apoe模擬肽的任何修飾。在具體實(shí)例中，融合蛋白包括n-末端?；?、c-末端酰胺化、n-末端脂肪酸修飾(如辛酸或肉豆蔻酸)和c-末端脂肪酸改性(如辛酸和肉豆蔻酸)中的一種或更多種。在一些方面，融合蛋白包括與seq?id?no:22-25中任一個(gè)的氨基酸序列具有至少90％序列同一性(例如至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性)的氨基酸序列。在其他實(shí)例中，融合蛋白的氨基酸序列包括seq?id?no:22-25中任一個(gè)的氨基酸序列或由seq?id?no:22-25中任一個(gè)的氨基酸序列組成。示例性融合蛋白包括表2中提供的那些。表2.示例性apoe模擬肽融合蛋白1：青霉胺2：n-甲基-甘氨酸3：n-甲基-亮氨酸4：6-氨基己酸ac：n-末端酰化nh2：c-末端酰胺化s5：(s)-α-甲基，α-戊烯基甘氨酸r8：(r)-α-甲基，α-辛烯基甘氨酸在一些方面，所公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白可以從各種來(lái)源分離。例如，所公開(kāi)的肽或融合蛋白可以通過(guò)化學(xué)合成(例如固相或溶液相合成)，隨后在適當(dāng)條件下反應(yīng)以在肽的兩個(gè)或多個(gè)非連續(xù)氨基酸之間產(chǎn)生一個(gè)或更多個(gè)共價(jià)連接。在一些實(shí)例中，共價(jià)連接是烴釘合(hydrocarbon?staple)或烴縫合(hydrocarbon?stitch)，以及烴釘合(hydrocarbon?staple)或烴縫合(hydrocarbon?stitch)是通過(guò)釕催化的復(fù)分解或雙環(huán)閉合復(fù)分解產(chǎn)生的。在一些方面，本文公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白保留apoe的一種或更多種活性，包括脂蛋白結(jié)合活性、ldlr結(jié)合活性、lrp1結(jié)合活性、硫酸乙酰肝素蛋白多糖(hspg)結(jié)合活性、介導(dǎo)細(xì)胞脂蛋白攝取、降低受試者的血清甘油三酯水平、降低受試者的總血清膽固醇水平和/或減少細(xì)胞或受試者中的病毒復(fù)制。在一些實(shí)例中，與對(duì)照(例如具有不包含共價(jià)連接或無(wú)肽/緩沖液的天然apoe序列的相應(yīng)肽)相比，所公開(kāi)的肽或融合蛋白將細(xì)胞脂蛋白攝取(如ldl、idl、hdl、lp(a)、乳糜微粒、乳糜微粒殘余物或vldl攝取)增加至少約5至40倍。在進(jìn)一步的實(shí)例中，當(dāng)施用于apoe-ko小鼠時(shí)，與對(duì)照組(例如具有不包含共價(jià)連接或無(wú)肽/緩沖液的天然apoe序列的相應(yīng)肽)相比，所公開(kāi)的肽或融合蛋白在一小時(shí)內(nèi)將血清甘油三酯降低至少約50％(例如至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或更多)。在另外的實(shí)例中，當(dāng)施用于apoe-ko小鼠時(shí)，與對(duì)照組(例如具有不包含共價(jià)連接或無(wú)肽/緩沖液的天然apoe序列的相應(yīng)肽)相比，所公開(kāi)的肽或融合蛋白在1-6小時(shí)內(nèi)將血清膽固醇降低至少約10％(例如，至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％或更多)。在進(jìn)一步的實(shí)例中，與對(duì)照(例如具有不包含共價(jià)連接或無(wú)肽/緩沖液的天然apoe序列的相應(yīng)肽)相比，所公開(kāi)的肽或融合蛋白將細(xì)胞中的病毒復(fù)制減少至少約50％。iii、藥物組合物和使用方法在示例性方面，將包含本文公開(kāi)的一種或更多種apoe模擬肽或融合蛋白的組合物以治療有效量施用于患有血脂異常疾病(例如高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥或心血管疾病)的受試者。在其他實(shí)例中，將本文公開(kāi)的治療有效量的apoe模擬肽或融合蛋白施用于apoe遺傳缺陷的受試者或患有異常β脂蛋白血癥的受試者(例如具有apoe2/e2等位基因的受試者)。在另外的實(shí)例中，將治療有效量的apoe模擬肽或融合蛋白施用于因ldlr突變而患有家族性高膽固醇血癥的受試者。在其他方面，將治療有效量的包含本文公開(kāi)的一種或更多種apoe模擬肽或融合蛋白的組合物施用于患有病毒感染或疾病的受試者。這些用途的有效劑量將取決于疾病的嚴(yán)重程度和受試者的總體健康狀況以及其他因素。該化合物的治療有效量是提供一種或更多種癥狀的主觀緩解或臨床醫(yī)生或其他合格觀察者所指出的客觀可識(shí)別的改善的量。apoe模擬肽或融合蛋白可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方式施用(參見(jiàn)，例如，banga,therapeutic?peptides?and?proteins,third?edition,taylor&francisgroup,2015)，例如通過(guò)肌肉內(nèi)、皮下或靜脈注射，或口服、鼻用、吸入或肛門給藥。在一個(gè)方面，通過(guò)靜脈注射施用。另一方面，施用是口服的。為了延長(zhǎng)apoe模擬肽或融合蛋白可用于抑制或治療血脂異常病癥或病毒感染的時(shí)間，肽可以作為植入物、油性注射劑或顆粒系統(tǒng)提供。顆粒系統(tǒng)可以是微粒、微膠囊、微球、納米膠囊或類似的顆粒。在具體方面，施用的apoe模擬肽包括seq?id?no:2-4、7-12、14-21和30-33中任一個(gè)的氨基酸序列。在其他方面，給受試者施用包含apoe模擬肽的融合蛋白，如seq?id?no:22-25中的任何一個(gè)。在一些實(shí)例中，所述方法包括向有需要的受試者施用治療有效量的公開(kāi)的apoe模擬肽或融合蛋白。在一些實(shí)例中，受試者是人或獸醫(yī)學(xué)受試者。在特定的例子中，受試者是人。在一些實(shí)例中，受試者患有高甘油三酯血癥。人受試者的正?；蚶硐胙甯视腿サ陀?50mg/dl。臨界高甘油三酯范圍為150-199mg/dl，高甘油三酯范圍為200-499mg/dl，極高的甘油三酯范圍是500mg/dl或更高。因此，在一些實(shí)例中，接受治療的受試者的血清甘油三酯為150mg/dl或更高。向受試者施用治療有效量的一種或更多種所公開(kāi)的肽或融合蛋白，例如導(dǎo)致血清甘油三酯水平降低約至少5％(例如至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％或更多)的量，例如，與施用肽或融合蛋白質(zhì)之前的甘油三酯水平相比。在其他實(shí)例中，所公開(kāi)的肽或融合蛋白的治療有效量將受試者的血清甘油三酯降低到小于150mg/dl。在一些實(shí)例中，受試者患有高膽固醇血癥，包括但不限于家族性高膽固醇血癥。成人受試者的正?；蚶硐肟偰懝檀嫉陀?00mg/dl(兒童低于170mg/dl)。成人的臨界高總膽固醇范圍為200-239mg/dl，高總膽固醇的范圍為240mg/dl或更高(兒童分別為170-199mg/dl和200mg/dl或更高)。因此，在一些實(shí)例中，接受治療的受試者是成年人并且具有200mg/dl或更高血清的總膽固醇水平。向受試者施用治療有效量的一種或更多種所公開(kāi)的肽或融合蛋白，例如導(dǎo)致血清總膽固醇水平降低約至少5％(例如至少約5％、至少約10％、至少約15％、至少約20％、至少約25％、至少約30％、至少約40％、至少約50％或更多)的量，例如，與施用肽或融合蛋白質(zhì)之前的總膽固醇水平相比。在其他實(shí)例中，所公開(kāi)的肽或融合蛋白的治療有效量將受試者的血清總膽固醇降低到小于200mg/dl。在其他方面，受試者患有或疑似患有病毒感染或疾病。在一些實(shí)例中，受試者感染或懷疑感染了包膜病毒。示例性包膜病毒包括流感病毒、皰疹病毒(如巨細(xì)胞病毒)、痘病毒、嗜肝dna病毒(如乙型肝炎病毒)、黃病毒(如登革熱病毒或西尼羅河病毒)、冠狀病毒(如β冠狀病毒)、正粘病毒、副粘病毒(如麻疹或腮腺炎)、絲狀病毒(如埃博拉病毒或馬爾堡病毒)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(如艾滋病毒)。在一些實(shí)例中，受試者感染(或疑似感染)β冠狀病毒，例如sars-cov-2。在一方面，給受試者施用治療有效量的肽，例如抑制病毒復(fù)制至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的量(與未進(jìn)行治療相比)。在另一方面，治療有效量是將受試者中的病毒滴度降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％所需的量(與未進(jìn)行治療相比)。在其他實(shí)例中，治療有效量也可以是減少或消除一種或更多種病毒感染的癥狀所需的量，例如減少或消除發(fā)燒、咳嗽或呼吸急促所需的數(shù)量，例如在呼吸道病毒如β冠狀病毒的情況下。所提供的apoe模擬肽或融合蛋白中的一種或更多種可以與一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑組合以用于給人或動(dòng)物受試者施用。remington:the?science?andpractice?of?pharmacy,adejare(ed.),academic?press,london,united?kingdom,23rdedition(2021)，描述了適用于一種或更多種治療化合物或分子的藥物遞送的組合物和制劑，例如一種或更多種單獨(dú)的肽或融合蛋白或與另外的藥劑組合。合適的藥學(xué)上可接受的載體、溶媒(vehicles)或賦形劑的實(shí)例包括無(wú)菌水溶液或非水溶液、懸浮液和/或乳液。非水溶劑的實(shí)例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油和可注射有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏油或固定油。靜脈注射載體包括液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏葡萄糖的那些)等。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。其他藥學(xué)上可接受的載體包括碳水化合物(例如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化劑(如抗壞血酸或谷胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑和防腐劑。一般而言，制劑是通過(guò)將一種或更多種公開(kāi)的肽或融合蛋白與藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑均勻且緊密地結(jié)合而制備的。適用于胃腸外施用的制劑包括水性和非水性無(wú)菌注射溶液，其中可能含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和溶質(zhì)，使制劑與預(yù)期接受者的血液等滲；以及可包括懸浮劑和增稠劑的水性和非水性無(wú)菌懸浮液。制劑可以裝在單位劑量或多劑量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，可以在冷凍干燥(凍干)條件下儲(chǔ)存，僅需要在使用前直接添加無(wú)菌液體載體，例如注射用水或生理鹽水。即時(shí)注射溶液和懸浮液可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常用的無(wú)菌粉末、顆粒和片劑制備。在一些方面，所公開(kāi)的肽或融合蛋白被配制成為與一種或更多種磷脂的復(fù)合物。在一方面，在給受試者施用之前，將一種或更多種公開(kāi)的肽或融合蛋白與磷脂或其他脂質(zhì)預(yù)復(fù)合成盤狀或球形顆粒。在一個(gè)實(shí)例中，肽與1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(dmpc)預(yù)復(fù)合。制備所公開(kāi)的肽與磷脂復(fù)合物的方法包括schwendeman?et?al.,j.lipidres.56:1727-1737,2015；yuan?et?al.,nanomedicine:nanotechnology,biology?andmedicine48:102646,2023；和shu?et?al.,aterioscler?thromb?vase?biol.30:2504-2509,2010中所述的方法。本文提供的肽、融合蛋白和藥物組合物，包括用于治療血脂異常病癥或病毒性疾病的那些，可以通過(guò)不同的途徑施用，例如口服(包括口腔和舌下)、直腸、胃腸外(包括靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi))、氣霧劑、鼻用、肌肉內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和局部。它們可以以不同的形式給藥，包括但不限于溶液、乳液和懸浮液、微球、顆粒、微粒、納米粒子和脂質(zhì)體。有效的肽、融合蛋白或藥物組合物的量取決于待治療的疾病或病癥的性質(zhì)，以及疾病或病癥所處的階段。有效量可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)確定。制劑中使用的精確劑量也取決于給藥途徑，并且應(yīng)根據(jù)醫(yī)療保健從業(yè)人員的判斷和每個(gè)受試者的情況來(lái)決定。這種劑量范圍的實(shí)例是約0.1mg/kg至約200mg/kg體重(例如，約0.1至約10mg/kg、約1至約25mg/kg、約5至約50mg/kg、約25至約75mg/kg、約50至約100mg/kg、約75至約150mg/kg或約100至約200mg/kg，例如約0.1mg/kg、約0.5mg/kg、約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約7.5mg/kg、約10mg/kg，約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約50mg/kg、約75mg/kg、約100mg/kg、約125mg/kg、約150mg/kg、約175mg/kg或約200mg/kg)，以單次或分次劑量給藥。劑量范圍的另一個(gè)例子是單次或分次劑量為1.0至100mg/kg體重。在一些方面，所公開(kāi)的肽、融合蛋白或藥物組合物每天兩次、每天、每隔一天、每周或以更低頻率施用。在一個(gè)具體實(shí)例中，每周一次向受試者靜脈注射肽、融合蛋白或組合物。在另一個(gè)具體實(shí)例中，每天一次向受試者口服施用肽、融合蛋白或組合物。治療可能會(huì)無(wú)限期地繼續(xù)，或者當(dāng)達(dá)到目標(biāo)臨床參數(shù)時(shí)可以停止，例如正常范圍的甘油三酯或總膽固醇水平或病毒感染的清除(例如，癥狀緩解或沒(méi)有病毒血癥)。任何特定受試者的具體劑量水平和給藥頻率可能會(huì)有所不同，并取決于許多因素，包括特定的疾病或狀況、特定化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)長(zhǎng)、接受治療的受試者的年齡、體重、總體健康狀況、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、排泄率、藥物組合以及病情的嚴(yán)重程度。所公開(kāi)的肽、融合蛋白或藥物組合物可以在整個(gè)治療期間以大約相同的劑量、遞增劑量方案或負(fù)荷劑量方案(例如，其中負(fù)荷劑量是約為維持劑量的兩到五倍)施用。在一些方面，劑量在治療過(guò)程中根據(jù)接受治療的受試者的狀況、疾病或狀況的嚴(yán)重程度、對(duì)治療的明顯反應(yīng)和/或通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員判斷的其他因素而變化。在另外的方面，所公開(kāi)的肽用于體外或離體方法，以促進(jìn)或增加從樣品例如血漿中去除vldl、ldl、lp(a)和/或脂蛋白x(lpx)。在一些方面，所公開(kāi)的肽用于ldl-單采術(shù)的方法(例如用于患有家族性高膽固醇血癥的受試者)。在一些方面，所述方法包括在足以使脂蛋白(例如ldl和/或vldl)與一種或更多種肽結(jié)合的條件下，使含有脂蛋白的樣品(如來(lái)自受試者的生物樣品，例如血漿)與一個(gè)或更多個(gè)公開(kāi)的肽接觸，從而形成肽/脂蛋白復(fù)合物。然后，在足以使肽/脂蛋白復(fù)合物與糖胺聚糖結(jié)合的條件下，使肽/脂蛋白復(fù)合物與糖胺聚糖(例如硫酸葡聚糖、肝素或硫酸乙酰肝素)接觸，從而形成肽/脂蛋白/糖胺聚糖復(fù)合物。在一個(gè)具體的例子中，糖胺聚糖是硫酸葡聚糖。從樣品中去除肽/脂蛋白/糖胺聚糖復(fù)合物，產(chǎn)生脂蛋白耗竭的血漿。在一些方面，糖胺聚糖被固定在固體支持物(例如柱)上或呈漿液形式。在一些實(shí)例中，該方法將樣品中脂蛋白(例如ldl)的量減少至少約30％(例如至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或更多)。在另外的實(shí)例中，與單獨(dú)使用糖胺聚糖相比，包含所公開(kāi)的肽或融合蛋白會(huì)增加從樣品中去除的脂蛋白(例如ldl)的量。在一些實(shí)例中，該方法可用于通過(guò)ldl單采術(shù)從受試者(例如患有家族性高膽固醇血癥的受試者)的血漿中去除脂蛋白(例如ldl)的方法。ldl單采系統(tǒng)包括級(jí)聯(lián)過(guò)濾(或脂質(zhì)過(guò)濾)、免疫吸附、肝素誘導(dǎo)的ldl沉淀、硫酸葡聚糖ldl吸附和ldl血液灌流。在一些方面，這些方法利用肝素誘導(dǎo)的ldl沉淀單采術(shù)。在一些實(shí)例中，使用血液處理系統(tǒng)(例如系統(tǒng)；kaneka?pharma?america?llc)從受試者移除血液并從血細(xì)胞中分離血漿。在足以使脂蛋白(例如ldl和/或vldl)與一種或更多種肽或融合蛋白結(jié)合的條件下，分離的血漿與一種或者多種公開(kāi)的肽或融合蛋白質(zhì)接觸，從而形成肽/脂蛋白復(fù)合物。然后，含有肽/脂蛋白復(fù)合物的血漿流過(guò)含有硫酸葡聚糖鏈的柱。肽/脂蛋白復(fù)合物保留在柱上，血漿中的脂蛋白量減少。血細(xì)胞被添加回血漿中并且血液被返回受試者體內(nèi)。實(shí)施例提供以下示例來(lái)說(shuō)明本公開(kāi)的各方面的特定特征。這些示例不應(yīng)被解釋為將本公開(kāi)限制于所描述的特定特征。實(shí)施例1?apoe模擬肽的體外測(cè)試如lucero?et?al.(j.lipid?res.63(1),article?100160,2022)所描述評(píng)估野生型和ldlr-ko?hepg2細(xì)胞中的脂質(zhì)攝取。簡(jiǎn)而言之，在實(shí)驗(yàn)前48小時(shí)，將hepg2細(xì)胞或hepg2ldlr?ko細(xì)胞接種在含有dmem、10％(v/v)fbs、100iu/ml青霉素g和100pg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基的96孔板中(每孔25000個(gè)細(xì)胞)。ldl、hdl或vldl中的蛋白質(zhì)用氨基反應(yīng)性熒光染料alexa?fluortm568?nhs酯(琥珀酰亞胺酯)(invitrogen)標(biāo)記。將最終總蛋白濃度為50μg/ml的alexa568-ldl(或-hdl或-vldl)與不同濃度的不同apoe肽或與相同量的緩沖液在dmem/0.1％bsa中混合。然后將alexa568-脂蛋白/肽混合物或alexa568脂蛋白在37℃下預(yù)孵育30分鐘。用pbs洗滌細(xì)胞，將alexa568-脂蛋白/肽混合物或dmem/0.1％bsa中的alexa568-脂蛋白加入96孔板上的細(xì)胞中(一式三份)并孵育1小時(shí)或4小時(shí)。用pbs洗滌細(xì)胞，用胰蛋白酶從孔中解離，并重新懸浮在冰冷的pbs/0.5％bsa/2.5mm?edta中。通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選(facs)流式細(xì)胞術(shù)(bd?lrsfortessa(bd?biosciences，franklin?lakes，nj))測(cè)量熒光來(lái)評(píng)估細(xì)胞對(duì)ldl/hdl/vldl的攝取。與對(duì)照肽相比，apoe模擬肽增強(qiáng)了野生型hepg2細(xì)胞對(duì)ldl的攝取(圖6a和6b)。這些肽還增強(qiáng)野生型hepg2細(xì)胞中vldl和hdl的攝取(圖7a和7b)。在肽濃度較高的情況下，無(wú)論是否存在ldlr，ldl攝取都會(huì)增加。然而，較低肽濃度下攝取的差異可能表明apoe肽還通過(guò)ldlr途徑介導(dǎo)ldl攝取(圖8和圖9a-9c)。實(shí)施例2?apoe模擬肽的體內(nèi)測(cè)試在apoe-ko小鼠身上測(cè)試了octac-e139-150和octan-e139-150肽的效果。小鼠保持正常飲食。在3.5個(gè)月齡時(shí)，將15只小鼠分為三組，每組5只，如下：1)對(duì)照組；2)octac-e139-150肽組；和3)octan-e139-150肽組。將肽以1.5mg/ml的濃度溶解在pbs中(810μmoctac-e139-150；849μm?octan-e139-150)。在肽施用前一天對(duì)小鼠稱重，計(jì)算每只小鼠接受4.6mg/kg肽(2.5μmol/kg)的肽量。將計(jì)算出的1.5mg/ml肽量放入注射器中，用pbs標(biāo)準(zhǔn)化至80μl。小鼠接受pbs(對(duì)照)或肽的靜脈注射。在注射前、注射后1小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)立即采集血液樣本。血液在4℃下以3000rpm離心20分鐘，分離血漿(20-30μl)并儲(chǔ)存在4℃。第二天，使用l型甘油三酯m測(cè)定法和膽固醇e試劑盒(wako，fujifilm?medical?systems?usa)測(cè)量血漿甘油三酯和總膽固醇。octa-e139-150和octan-e139-150肽在施用后至少6小時(shí)內(nèi)顯著降低小鼠的血漿總膽固醇(圖10a)。此外，肽顯著降低血漿甘油三酯水平，盡管這種作用是短暫的(圖10b)。實(shí)施例3apoe模擬肽對(duì)病毒復(fù)制的影響小鼠肝炎病毒(mhv)是一種β冠狀病毒，通過(guò)小鼠ceacam1受體(mcc1a受體)感染小鼠細(xì)胞。被修飾以表達(dá)mcc1a受體的hela(人上皮)細(xì)胞可以被mhv感染。本實(shí)驗(yàn)中使用的重組mhv已經(jīng)過(guò)修飾，使其含有額外的核衣殼(n)蛋白片段，該片段在n端與綠色熒光蛋白標(biāo)簽(gfp)融合(參見(jiàn)verheijeet?al.,j.virol.84:11575-1579，2010)。當(dāng)細(xì)胞感染mhv時(shí)，mhv復(fù)制產(chǎn)生更多的gfp并增強(qiáng)熒光信號(hào)。hela?mcc1a細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)。細(xì)胞在37℃下用mhv-gfp感染2小時(shí)。將病毒儲(chǔ)備溶液稀釋40倍。通過(guò)用mhv-gfp感染hela細(xì)胞3天并收集細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)制備原液。用pbs洗滌細(xì)胞并用含有apoe肽(15μm)的培養(yǎng)基(dmem加10％fbs，100iu/ml青霉素g，100μg/ml鏈霉素，0.5mg/ml?g418)或不含肽的培養(yǎng)基處理并在37℃下孵育16小時(shí)。用pbs洗滌細(xì)胞并使用熒光板讀數(shù)器在板上測(cè)量細(xì)胞中的總gfp熒光(ex/em?488/520)。如圖11所示，用octac-e139-150或縫合的e134-150肽處理顯示mhv-gfp熒光顯著降低，表明經(jīng)處理的細(xì)胞中病毒復(fù)制減少。實(shí)施例4apoe模擬肽的額外體外表征研究烴釘合對(duì)apoe模擬肽物理性質(zhì)的影響。在20℃下，100μm肽在水溶液中的圓二色性表明，烴釘合的肽呈α-螺旋，而未修飾的肽是無(wú)序的(圖12)。為了評(píng)估未修飾肽與?；敽想牡闹|(zhì)結(jié)合特性，進(jìn)行了dmpc囊泡溶解試驗(yàn)。未修飾的線性肽e139-150不溶解dmpc磷脂囊泡，而酰化的釘合肽溶解dmpc磷脂囊泡(圖13)。這表明烴釘合和肽?；黾恿穗牡闹|(zhì)結(jié)合親和力。最終蛋白濃度為50μg/ml的熒光標(biāo)記ldl或vldl(alexa?fluor?568-nhs酯)在37℃下與或不與apoe肽預(yù)孵育30分鐘。ldl攝取的肽終濃度為10μm，vldl攝取研究的肽終濃度為5μm。然后將野生型hepg2細(xì)胞與脂蛋白/肽混合物在37℃下孵育1小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估脂蛋白攝取。如圖14a、14b和6b所示，烴釘合肽，特別是酰化釘合肽增加hepg2細(xì)胞對(duì)ldl和vldl的攝取。由于陽(yáng)離子兩親性肽可能具有細(xì)胞毒性，因此還測(cè)試了肽對(duì)細(xì)胞的潛在細(xì)胞毒性作用。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(dojindo)用于評(píng)估增加肽濃度對(duì)野生型hepg2細(xì)胞存活率的影響。在脂質(zhì)攝取研究中使用的條件下，沒(méi)有肽對(duì)wt?hepg2細(xì)胞具有細(xì)胞毒性(圖15)。實(shí)施例5apoe模擬肽促進(jìn)ldl與肝素結(jié)合據(jù)觀察，apoe模擬肽促進(jìn)ldl與肝素的結(jié)合。這已通過(guò)生物層干涉術(shù)(bli)和肝素色譜法得到證實(shí)。將生物素化肝素固定在bli鏈霉親和素(sa)生物傳感器(sartorius)上。在pbs、0.1％bsa中測(cè)量100nm?ldl、5μm?myrn-e141-150-aml或預(yù)復(fù)合100nm?ldl和5μmmyrn-e14-150-aml與肝素的結(jié)合(圖16)。將400μl?1μm?ldl或1μm?ldl與20μm?myrn-e141-150-aml預(yù)復(fù)合物注射到1ml?hitrap肝素hp柱中。用10ml緩沖液(10mm磷酸鈉，0.15m?nacl，ph?7.4)洗滌柱，用nacl的線性梯度(10mm磷酸鹽鈉，ph?7.4，0.15m-2m?nacl梯度)洗脫ldl或ldl/肽復(fù)合物(圖17)。測(cè)試了硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan?sulfate?proteoglycan,hspg)在肽介導(dǎo)的ldl攝取中的參與情況。wt?hepg2細(xì)胞用肝素酶i、ii和iii的混合物(ibexpharmaceuticals)預(yù)處理，以降解細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素鏈。接下來(lái)，用octac-e139-150-s和myrn-e141-150-aml肽進(jìn)行l(wèi)dl攝取研究(圖18a-18c)。不添加肽的ldl攝取不受肝素酶處理的影響，但肝素酶處理減弱了低劑量肽對(duì)ldl攝取的影響(圖18a)。在較高的肽濃度下，肝素酶治療的效果較低，部分?jǐn)z取得到恢復(fù)。類似地，肝素酶處理減弱了野生型hepg2細(xì)胞中myrn-e141-150-aml介導(dǎo)的ldl攝取(圖18c)。這表明在低肽濃度下hspg在肽介導(dǎo)的ldl攝取中發(fā)揮作用，但在高肽濃度下其作用較低。ldlr-ko?hepg2細(xì)胞的相同實(shí)驗(yàn)顯示了類似的結(jié)果(圖18b)，表明在較高的肽劑量下，一些其他受體，例如lrp1，可能參與肽介導(dǎo)的攝取，或者存在一些非特異性肽介導(dǎo)攝取。將最終蛋白濃度為50μg/ml的熒光標(biāo)記ldl(alexa?fluor?568-nhs酯)與或不與10μm?myrn-e141-150-aml肽在37℃下預(yù)孵育30分鐘(在含0.1％bsa的dmem(無(wú)酚紅，無(wú)血清)中制備的溶液)。向一些ldl和一些ldl/肽樣品中加入肝素(最終濃度為10usp/ml；肝素，來(lái)自豬腸粘膜的鈉注射液(fresenius?kabi?usa，lake?zurich，il))?；旌衔镌?7℃下再預(yù)孵育5分鐘。接下來(lái)，將野生型hepg2細(xì)胞與ldl/肽/肝素混合物在37℃下孵育1小時(shí)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估脂蛋白攝取。肝素降低了myrn-e141-150-aml肽對(duì)野生型hepg2細(xì)胞中l(wèi)dl攝取的影響(圖19)。實(shí)施例6apoe模擬肽的其他體內(nèi)表征在單劑量apoe?ko小鼠研究中測(cè)試了myrn-e139-150和octan-e139-150肽。apoeko小鼠(n＝9)分為3組：對(duì)照組(pbs)，n＝3；myrn-e139-150(2.5μmol/kg；4.6mg/kg)，n＝3；octan-e139-150(2.5μmol/kg；4.4mg/kg)，n＝3。在整個(gè)研究過(guò)程中，小鼠以正常飲食飼養(yǎng)。靜脈注射肽，并在注射前和注射肽后1小時(shí)、3小時(shí)和6小時(shí)采集血液樣本。血漿總膽固醇和甘油三酯的測(cè)量如實(shí)施例2所述。肽降低血漿總膽固醇(圖20a；3小時(shí)時(shí)為37％；6小時(shí)時(shí)為29％)和甘油三酯(圖20b；1小時(shí)時(shí)為30-50％)。在單劑量ldlr-ko小鼠研究中測(cè)試了myrn-e141-150-aml和octan-e141-150。ldlr-ko小鼠(n＝9)分為3組：對(duì)照組(pbs)，n＝3；myrn-e141-150-aml(2.5μmol/kg；4.6mg/kg)，n＝3；octan-e141-150(2.5μmol/kg；4.4mg/kg)，n＝3。在整個(gè)研究過(guò)程中，小鼠以正常飲食飼養(yǎng)。靜脈注射肽，并在注射前和注射肽后1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和24小時(shí)采集血液樣本。血漿總膽固醇的測(cè)定如實(shí)施例2所述。注射3小時(shí)和6小時(shí)后，myrn-e141-150-aml將血漿總膽固醇降低約15-30％(圖21a)。顯然，在不脫離本公開(kāi)所描述方面的精神的情況下，可以變化或修改所描述的方法或組合物的精確細(xì)節(jié)。我們要求所有這些修改和變化都在以下權(quán)利要求的范圍和精神之內(nèi)。

背景技術(shù)：

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路