本公開總體上涉及微生物宿主細(xì)胞、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵、蛋白質(zhì)生產(chǎn)等領(lǐng)域。本公開的某些方面涉及新型前區(qū)核酸(dna)序列、包含新型前區(qū)dna序列的重組多核苷酸、包含一個或多個引入的多核苷酸的經(jīng)遺傳修飾(重組)的革蘭氏陽性細(xì)菌菌株等，該一個或多個引入的多核苷酸包含可操作地連接到編碼目的蛋白的核酸(dna)序列的新型前區(qū)dna序列。相關(guān)申請的交叉引用本技術(shù)要求2022年4月01日提交的美國臨時申請?zhí)?3/326,615的權(quán)益，該臨時申請通過引用以其全文特此并入。序列表的引用命名為“nb41862wopct_sequencelisting.xml”的文本文件序列表的電子提交的內(nèi)容創(chuàng)建于2023年3月29日，并且大小為51kb，將其通過引用以其全文特此并入。

背景技術(shù)：

1、革蘭氏陽性微生物因其將其發(fā)酵產(chǎn)物分泌到其培養(yǎng)基中的能力而常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵。分泌的蛋白質(zhì)通過細(xì)胞膜和細(xì)胞壁輸出，并且然后在隨后釋放到外部介質(zhì)中。例如，大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵和分泌異源多肽是廣泛應(yīng)用于工業(yè)的技術(shù)，其中用編碼待表達(dá)的異源多肽的核酸轉(zhuǎn)化微生物細(xì)胞。盡管在蛋白質(zhì)生產(chǎn)方法中有多種進(jìn)展，但本領(lǐng)域仍需要提供更高效的蛋白表達(dá)方法，其旨在增強用于多種工業(yè)用途的目的蛋白的生產(chǎn)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、如本文總體所述，本公開尤其提供了用于在革蘭氏陽性細(xì)菌(宿主)細(xì)胞中生產(chǎn)目的蛋白的組合物和方法。某些實施例涉及新型前區(qū)核酸(dna)序列、包含新型前區(qū)dna序列的重組多核苷酸(例如，載體、質(zhì)粒、表達(dá)盒等)、包含可操作地連接到下游(3’)基因編碼序列的新型前區(qū)序列的重組多核苷酸、包含可操作地連接到編碼前蛋白信號(分泌)序列的上游(5’)dna序列的新型前區(qū)序列的重組多核苷酸等。

2、在某些方面，本公開提供了重組革蘭氏陽性細(xì)菌菌株，這些菌株表達(dá)一個或多個引入的編碼目的蛋白的多核苷酸。在特定的實施例中，一個或多個引入的多核苷酸包含可操作地連接到編碼目的蛋白的dna序列(該編碼目的蛋白的dna序列可包含可操作地連接到其上的上游(5’)蛋白信號序列)的新型前區(qū)dna序列。在某些其他方面，本公開提供了用于設(shè)計/構(gòu)建表達(dá)編碼目的蛋白的一個或多個引入的新型多核苷酸構(gòu)建體的重組革蘭氏陽性細(xì)菌菌株的組合物和方法、用于培養(yǎng)表達(dá)目的蛋白的重組菌株的組合物和方法、用于增強目的蛋白的生產(chǎn)的組合物和方法等。

3、例如，在一個或多個實施例中，本公開提供了如seq?id?no:9、seq?id?no:11、seqid?no:14、seq?id?no:29、seq?id?no:30、seq?id?no:32和seq?id?no:33中一個或多個氨基酸序列和/或其組合所示的新型變體前區(qū)序列。在其他一個或多個實施例中，本公開提供了如圖1、圖2、或圖3和/或其組合所示的新型變體前區(qū)序列。在又其他一個或多個實施例中，本公開提供了表1-5之一和/或其組合所示或描述的新型變體前區(qū)序列。

4、因此，某些一個或多個實施例涉及包含一個或多個氨基酸取代、一個或多個氨基酸插入等的變體(突變體)前區(qū)序列。在某些實施例中，變體前區(qū)序列包含位置30處的氨基酸取代，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:15編號。在其他實施例中，變體前區(qū)序列包含位置30和選自1、2、3、4、6、14、16、19、20、23、36、37、38、39、42、43、44、49、50、64、65、67、68、71、79、83和84的一個或多個位置處的氨基酸取代，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:15編號。在一個或多個其他實施例中，變體前區(qū)序列衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:15的位置1-84具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％序列同一性。在某些其他實施例中，變體前區(qū)序列包含位置2處的至少甘氨酸(g)和位置3處的賴氨酸(k)的氨基酸插入，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:14編號。在其他一個或多個實施例中，變體前區(qū)序列包含位置2處的至少甘氨酸(g)和位置3處的賴氨酸(k)的氨基酸插入，以及選自1、32、38、46、66、67、70和73的一個或多個位置處的氨基酸取代，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:14編號。在一些其他實施例中，變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:14的位置1-86具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在又其他實施例中，變體前區(qū)序列包含位置2處的至少甘氨酸(g)、位置3處的賴氨酸(k)和位置4處的丙氨酸(a)的氨基酸插入，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:30編號。在某些方面，變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:30的位置1-87具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在某些其他一個或多個實施例中，變體前區(qū)序列包含位置2處的至少甘氨酸(g)、位置3處的賴氨酸(k)和位置4處的絲氨酸(s)的氨基酸插入，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:29編號。在一些其他實施例中，變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:29的位置1-87具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在其他一個或多個實施例中，變體前區(qū)序列包含位置2處的至少甘氨酸(g)、位置3處的賴氨酸(k)、位置4處的丙氨酸(a)和位置5處的丙氨酸(a)的氨基酸插入，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:31編號。在某些一個或多個實施例或方面中，變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:31的位置1-88具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％氨基酸序列同一性。在其他實施例中，變體前區(qū)序列包含位置30處的谷氨酸(e)至甘氨酸(g)取代(e30g)、位置68處的亮氨酸(l)至賴氨酸(k)取代(l68k)和位置73處的異亮氨酸(i)至纈氨酸(v)取代(i72v)，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:32編號。在其他一個或多個方面或?qū)嵤├?，變體前區(qū)序列包含位置30處的谷氨酸(e)至甘氨酸(g)取代(e30g)、位置68處的亮氨酸(l)至賴氨酸(k)取代(l68k)和位置80處的谷氨酸(e)至異亮氨酸(i)取代(e80i)，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:33編號。在某些實施例中，變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:15、seq?id?no:32和/或seq?id?no:33的位置1-84具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。在其他方面，本公開的變體前區(qū)包含表1-5、圖1、圖2、圖3、seq?id?no:9、seq?id?no:11、seq?id?no:14、seq?id?no:29、seq?idno:30、seq?id?no:32、seq?id?no:33中任一項及其組合所示的氨基酸修飾。在一個或多個實施例中，包含表1-5、圖1、圖2、圖3、seq?id?no:9、seq?id?no:11、seq?id?no:14、seq?idno:29、seq?id?no:30、seq?id?no:32、seq?id?no:33中任一項及其組合所示的氨基酸修飾的變體前區(qū)衍生自親本多肽或參比多肽，該親本多肽或參比多肽與seq?id?no:15具有至少70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性。

5、因此，某些其他一個或多個實施例提供了編碼本公開的新型變體前區(qū)序列的重組核酸。因此，某些實施例涉及包含變體前區(qū)核酸等的多核苷酸。在一個或多個實施例中，本公開提供了包含編碼本公開變體前區(qū)的上游(5’)核酸(序列)的多核苷酸，該上游核酸(序列)可操作地連接到編碼異源目的蛋白(poi)的下游(3’)核酸序列。在某些其他方面，本公開提供了多核苷酸，這些多核苷酸包含編碼前蛋白信號(分泌)序列的上游(5′)核酸，該上游核酸可操作地連接到編碼本公開變體前區(qū)的下游(3′)核酸序列，該編碼本公開變體前區(qū)的下游核酸序列可操作地連接到編碼目的蛋白(poi)的下游核酸序列。某些其他實施例涉及表達(dá)盒，這些表達(dá)盒包含可操作地連接到本公開的下游(3’)多核苷酸的上游(5’)啟動子區(qū)序列。

6、在某些其他一個或多個實施例中，本公開涉及包含本公開的一個或多個引入的多核苷酸或表達(dá)盒的重組(經(jīng)修飾的)革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞/菌株。因此，本公開的其他實施例涉及用于在本文闡述和描述的重組革蘭氏陽性細(xì)胞中生產(chǎn)異源目的蛋白的方法/工藝。

7、在一些一個或多個實施例中，本公開提供了用于在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)異源poi的方法，這些方法包括將表達(dá)盒引入革蘭氏陽性細(xì)胞，該表達(dá)盒包含可操作地連接到編碼變體前區(qū)的下游核酸序列的上游啟動子區(qū)，該變體前區(qū)包含位置30和選自1、2、3、4、6、14、16、19、20、23、36、37、38、39、42、43、44、49、50、64、65、67、68、71、79、83和84的一個或多個位置處的氨基酸取代，其中該變體前區(qū)核酸(序列)可操作地連接到編碼該poi的下游核酸序列，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:15進(jìn)行編號；以及在用于生產(chǎn)該poi的條件下使經(jīng)修飾的細(xì)胞生長/培養(yǎng)/發(fā)酵。在某些其他實施例中，本公開提供了用于在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)異源poi的方法，這些方法包括將表達(dá)盒引入革蘭氏陽性細(xì)胞，該表達(dá)盒包含可操作地連接到編碼變體前區(qū)的下游核酸(序列)的上游啟動子區(qū)序列，該變體前區(qū)包含位置2處的甘氨酸(g)和位置3處的賴氨酸(k)的氨基酸插入，以及選自1、32、38、46、66、67、70和73的一個或多個位置處的氨基酸取代，其中該變體前區(qū)核酸(序列)可操作地連接到編碼poi的下游核酸序列，其中該變體前區(qū)的氨基酸位置根據(jù)seq?id?no:14進(jìn)行編號；以及在用于生產(chǎn)該poi的條件下使經(jīng)修飾的細(xì)胞生長/培養(yǎng)/發(fā)酵。在又其他實施例中，本公開涉及用于在革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞中生產(chǎn)異源poi的方法，這些方法包括向革蘭氏陽性細(xì)胞中引入本公開的表達(dá)盒，以及在用于生產(chǎn)該poi的條件下使經(jīng)修飾的細(xì)胞生長/培養(yǎng)/發(fā)酵。在這些方法的某些一個或多個實施例中，該盒包含編碼前蛋白信號(分泌)序列的核酸(序列)，該核酸(序列)可操作地連接并且位于啟動子與變體前區(qū)序列之間。在這些方法的一些其他實施例中，相對于對照革蘭氏陽性細(xì)胞，經(jīng)修飾的細(xì)胞生產(chǎn)增加量的poi。例如，如下對照革蘭氏陽性細(xì)胞，其包含引入的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含可操作地連接到編碼包含seq?id?no:15的前區(qū)序列的下游核酸的相同的上游啟動子序列(即，與經(jīng)修飾的細(xì)胞相同)，該編碼前區(qū)序列的下游核酸可操作地連接到編碼相同poi(即，與經(jīng)修飾的細(xì)胞相同的poi)的下游核酸序列。在這些方法的某些實施例中，將引入的盒整合到該細(xì)胞的基因組中。在這些方法的某些實施例中，將至少兩個盒引入該細(xì)胞。本文描述了本公開的某些其他一個或多個實施例并如下文闡述。