背景技術(shù)：

1、增加信使核糖核酸(mrna)效力的努力已經(jīng)專注于具有開放閱讀框(orf)的最佳序列設(shè)計(jì)的mrna。然而，需要通過利用rna生物學(xué)來進(jìn)一步提高mrna表達(dá)的效力和持久性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開尤其提供了編碼多肽的多核苷酸(例如，mrna)，其中所述多核苷酸包含：(a)5'-utr(例如，如本文所描述)；(b)編碼區(qū)，所述編碼區(qū)包含終止元件(例如，如本文所描述)；以及(c)3'-utr(例如，如本文所描述)，以及包含所述多核苷酸的lnp組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，編碼區(qū)包含多核苷酸序列，例如mrna，例如編碼肽或多肽有效載荷，例如治療性有效載荷或預(yù)防性有效載荷的開放閱讀框(orf)。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸，例如mrna，或由多核苷酸編碼的多肽相比缺乏本文所描述的5'-utr、3'-utr或終止元件的型式具有增加的水平和/或活性，例如表達(dá)或半衰期。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸，例如mrna的水平和/或活性增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，由多核苷酸編碼的多肽的水平、活性和/或表達(dá)持續(xù)時(shí)間增加。本文還公開了使用包含本文所公開的多核苷酸的lnp組合物用于治療疾病或病癥或用于促進(jìn)受試者中的所需生物作用的方法。將了解，任何orf可以與所公開的元件組合，例如，編碼無論是例如細(xì)胞內(nèi)的、跨膜的還是分泌的多肽或肽的orf。本公開的額外方面在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。

2、具體來說，在一些實(shí)施方案中，本文提供了包含5′utr、編碼多肽的開放閱讀框和3′utr的信使rna(mrna)，其中所述3′utr包含：

3、(i)與seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?idno：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147的核酸序列至少98％同一的核苷酸序列；或

4、(ii)對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seqid?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147的核酸序列或其缺失變體的核苷酸序列，在所述缺失變體中1至75個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seqid?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失，其中所述核酸序列或其缺失變體被修飾為包括：

5、a)插入所述核酸序列或其缺失變體內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)，和/或

6、b)插入所述核酸序列或其缺失變體內(nèi)的tent募集序列、fut8募集序列、一個(gè)或多個(gè)鑒定和比率確定(idr)序列、一個(gè)或多個(gè)核糖體接合檢測測定(reda)序列，或一個(gè)或多個(gè)idr序列與一個(gè)或多個(gè)reda序列的組合。

7、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：139的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：139所示的核酸序列。

8、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：140的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：140所示的核酸序列。

9、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：141的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：141所示的核酸序列。

10、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：142的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：142所示的核酸序列。

11、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：143的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：143所示的核酸序列。

12、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：144的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：144所示的核酸序列。

13、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：145的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：145所示的核酸序列。

14、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：146的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：146所示的核酸序列。

15、在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含與seq?id?no：147的核酸序列至少99％同一的核苷酸序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了一種3′utr，所述3′utr包含seq?id?no：147所示的核酸序列。

16、在本公開的一些方面，3′utr包含對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?idno：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147的核酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸序列被修飾為包括插入所述核酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)選自seqid?no：148-157。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)包含seq?id?no：149的至少一個(gè)拷貝和seq?id?no：150的至少一個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)包含seq?id?no：150的至少三個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)包含seq?id?no：149的至少兩個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)包含seqid?no：149的至少兩個(gè)拷貝和seq?id?no：150的至少一個(gè)拷貝。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)mirna結(jié)合位點(diǎn)包含seq?id?no：148的至少三個(gè)拷貝。

17、在本文所提供的一些方面，3′utr包含對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seqid?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147的核酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸序列被修飾為包括插入所述核酸序列內(nèi)的tent募集序列。

18、在本文所提供的一些實(shí)施方案中，3′utr包含對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seqid?no：146或seq?id?no：147的核酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸序列被修飾為包括插入所述核酸序列內(nèi)的fut8募集序列。

19、在本文所提供的一些情況下，3′utr包含對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?idno：146或seq?id?no：147的核酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸序列被修飾為包括插入所述核酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)idr序列。

20、在本文所提供的一些方面，3′utr包含對應(yīng)于seq?id?no：139、seq?id?no：140、seqid?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147的核酸序列的核苷酸序列，其中所述核酸序列被修飾為包括插入所述核酸序列內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)reda序列。

21、在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至60個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?idno：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至50個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至40個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?idno：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至30個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?idno：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至20個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?idno：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中1至10個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?id?no：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。在本文所提供的一些方面，在缺失變體中少于10個(gè)連續(xù)核苷酸從seq?id?no：139、seq?id?no：140、seq?idno：141、seq?id?no：142、seq?id?no：143、seq?id?no：144、seq?id?no：145、seq?id?no：146或seq?id?no：147中缺失。

22、在上文所描述的mrna中的任一者的某些實(shí)施方案中，5′utr包含與seq?id?no：50至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

23、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：139所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

24、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：140所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

25、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：141所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

26、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：142所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

27、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：143所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

28、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：144所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

29、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：145所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

30、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：146所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

31、在本文所提供的某些實(shí)施方案中，3′utr包含seq?id?no：147所示的核酸序列，并且其中5′utr包含seq?id?no：50所示的核酸序列。

32、在上文所描述的mrna中的任一者的某些方面，mrna包含終止盒。在一些實(shí)施方案中，終止盒選自seq?id?no：158-174。在一些實(shí)施方案中，終止盒是uaaagcuccccgggg(seqid?no：165)或uaagcccc?uccgggg(seq?id?no：164)。

33、在上文所描述的mrna中的任一者的某些方面，mrna包含5′末端帽。在一些實(shí)施方案中，5′末端帽包含m7gpppg2’omc、m7g-ppp-gm-a、m7g-ppp-gm-ag、帽0、帽1、arca、肌苷、n1-甲基-鳥苷、2′-氟-鳥苷、7-脫氮-鳥苷、8-氧代-鳥苷、2-氨基-鳥苷、lna-鳥苷、2-疊氮鳥苷、帽2、帽4、5′甲基g帽或其類似物。

34、在上文所描述的mrna中的任一者的某些方面，mrna包含多聚a區(qū)。在一些實(shí)施方案中，多聚a區(qū)的長度為至少約10、至少約20、至少約30、至少約40、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90個(gè)核苷酸，或長度為至少約100個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多聚a區(qū)的長度為約10至約200、約20至約180、約50至約160、約70至約140或約80至約120個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多聚a區(qū)包含a100-ucuag-a20-反向脫氧-胸苷。

35、在上文所描述的mrna中的任一者的某些方面，mrna包含至少一個(gè)化學(xué)修飾的核堿基、糖、主鏈或它們的任何組合。在一些實(shí)施方案中，至少一個(gè)化學(xué)修飾的核堿基選自由以下組成的組：假尿嘧啶(ψ)、n1-甲基假尿嘧啶(m1ψ)、1-乙基假尿嘧啶、2-硫尿嘧啶(s2u)、4′-硫尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶和它們的任何組合。

36、在上文所描述的mrna中的任一者的某些方面，多肽包含分泌蛋白、膜結(jié)合蛋白或細(xì)胞間蛋白。在一些實(shí)施方案中，多肽是細(xì)胞因子、抗體、疫苗、受體、酶、激素、轉(zhuǎn)錄因子、配體、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體、結(jié)構(gòu)蛋白、核酸酶或其組分、變體或片段。

37、本文還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含上文所描述的mrna中的任一者和藥學(xué)上可接受的載體。

38、本文還提供了脂質(zhì)納米顆粒，所述脂質(zhì)納米顆粒包含上文所描述的mrna中的任一者。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含：(i)可電離脂質(zhì)，(ii)磷脂，(iii)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，和(iv)peg-脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含式(i)化合物：

39、或其n-氧化物，或其鹽或異構(gòu)體，

40、其中r′a是r′支鏈；其中

41、r′支鏈?zhǔn)牵浩渲斜硎具B接點(diǎn)；

42、其中raα、raβ、raγ和raδ各自獨(dú)立地選自由h、c2-12烷基和c2-12烯基組成的組；

43、r2和r3各自獨(dú)立地選自由c1-14烷基和c2-14烯基組成的組；

44、r4選自由以下組成的組：-(ch2)noh，其中n選自由1、2、3、4和5組成的組，和

45、其中表示連接點(diǎn)；其中

46、r10是n(r)2；每個(gè)r獨(dú)立地選自由c1-6烷基、c2-3烯基和h組成的組；并且n2選自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10組成的組；

47、每個(gè)r5獨(dú)立地選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；

48、每個(gè)r6獨(dú)立地選自由c1-3烷基、c2-3烯基和h組成的組；

49、m和m′各自獨(dú)立地選自由-c(o)o-和-oc(o)-組成的組；

50、r′是c1-12烷基或c2-12烯基；

51、1選自由1、2、3、4和5組成的組；并且

52、m選自由5、6、7、8、9、10、11、12和13組成的組。

53、在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含：

54、(a)(i)化合物ii，(ii)膽固醇，和(iii)peg-dmg或化合物i；

55、(b)(i)化合物vi，(ii)膽固醇，和(iii)peg-dmg或化合物i；

56、(c)(i)化合物ii，(ii)dspc或dope，(iii)膽固醇，和(iv)peg-dmg或化合物i；

57、(d)(i)化合物vi，(ii)dspc或dope，(iii)膽固醇，和(iv)peg-dmg或化合物i；

58、(e)(i)化合物ii，(ii)膽固醇，和(iii)化合物i；

59、(f)(i)化合物ii，(ii)dspc或dope，(iii)膽固醇，和(iv)化合物i；

60、(g)(i)化合物b，(ii)dspc或dope，(iii)膽固醇，和(iv)peg-dmg或化合物i；

61、(h)(i)化合物b，(ii)膽固醇，和(iii)化合物i；或

62、(i)(i)化合物b，(ii)dspc或dope，(iii)膽固醇，和(iv)化合物i。

63、在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含化合物ii和化合物i。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含化合物b和化合物i。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含化合物ii、dspc、膽固醇和化合物i。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒包含摩爾比為約20-60％的可電離脂質(zhì)：5-25％的磷脂：25-55％的膽固醇：和0.5-15％的peg脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)納米顆粒被配制成用于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)直腸、經(jīng)肺或經(jīng)口遞送。

64、本文還提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者。本文還提供了細(xì)胞，所述細(xì)胞包含上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者。

65、在一些實(shí)施方案中，本文還提供了增加多肽表達(dá)的方法，所述方法包括向細(xì)胞施用上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者。

66、本文還提供了將上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者遞送至細(xì)胞的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞在體外、體內(nèi)或離體與所述脂質(zhì)納米顆粒接觸。

67、在一些情況下，本文還提供了將上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者遞送至患有疾病或病癥的人類受試者的方法，所述方法包括向有需要的所述人類受試者施用有效量的所述脂質(zhì)納米顆粒。

68、本文還提供的其它方面是治療、預(yù)防有需要的人類受試者的疾病或病癥或預(yù)防所述疾病或病癥的癥狀的方法，所述方法包括向所述人類受試者施用有效量的上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者。

69、本文還提供的其它方面是治療、預(yù)防有需要的人類受試者的疾病或病癥或預(yù)防所述疾病或病癥的癥狀的方法，所述方法包括向所述人類受試者施用有效量的上文所描述的脂質(zhì)納米顆粒中的任一者。

70、本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)根據(jù)以下詳細(xì)描述和圖式以及根據(jù)權(quán)利要求將顯而易見。