本發(fā)明涉及一種用于恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞的制備方法以及由該方法獲得的增殖性髓樣細(xì)胞及使用該增殖性髓樣細(xì)胞的藥物。

背景技術(shù)：

1、白細(xì)胞介素-12p70(il-12p70)是由巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dc)等髓樣細(xì)胞響應(yīng)感染或癌癥而產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子，其激活t細(xì)胞和nk細(xì)胞并促進(jìn)干擾素γ(ifn-γ)的產(chǎn)生。當(dāng)ifn-γ產(chǎn)生被促進(jìn)時，抗原呈遞增加，細(xì)胞免疫應(yīng)答被誘導(dǎo)，并且血管生成等的腫瘤發(fā)展過程受到阻止。因此，il-12p70一直被期待用作癌癥治療藥，但由于與il-12p70的全身施用相關(guān)的施用量限制性毒性，妨礙了其在癌癥治療中的應(yīng)用(非專利文獻(xiàn)1)。

2、通過誘導(dǎo)由dc產(chǎn)生il-12p70而主動地引發(fā)癌癥反應(yīng)性t細(xì)胞應(yīng)答的策略是在癌治療中可期待優(yōu)異臨床效果的一種方法。目前，在通過使自體dc負(fù)載癌抗原并返回到患者體內(nèi)來激活抗腫瘤免疫應(yīng)答的所謂dc疫苗療法中，通常使用單核細(xì)胞來源的dc。然而，由于單核細(xì)胞在外周血中的存在量極少且不能通過培養(yǎng)擴增，從而難以制備治療有效量的dc。此外，單核細(xì)胞來源的dc的il-12p70產(chǎn)生量在患者間不同，未得到充分的抗腫瘤效果。

3、為了解決上述各問題，本申請的發(fā)明人反復(fù)對由ips細(xì)胞制作增殖性髓樣細(xì)胞的方法進(jìn)行了改良(專利文獻(xiàn)1及2、非專利文獻(xiàn)2)。然而，迄今為止所報道的增殖性髓樣細(xì)胞的抗腫瘤效果不如單核細(xì)胞來源的dc。

4、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

5、專利文獻(xiàn)

6、專利文獻(xiàn)1：國際公開第2012/043651號公報

7、專利文獻(xiàn)2：國際公開第2021/230304號公報

8、非專利文獻(xiàn)

9、非專利文獻(xiàn)1：clin.cancer?res.3：409-417，1997

10、非專利文獻(xiàn)2：j.immunol.regen.med.12：100042，2021

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的問題

2、本發(fā)明的目的在于提供一種能夠恒定地產(chǎn)生il-12p70并發(fā)揮優(yōu)異的抗腫瘤效果的增殖性髓樣細(xì)胞及其制備方法。

3、解決問題的手段

4、作為深入研究的結(jié)果，本申請的發(fā)明人成功地制備出了il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞，該增殖性髓樣細(xì)胞無論是否被cd40-cd40配體相互作用或toll樣受體刺激等誘導(dǎo)均能恒定且大量地產(chǎn)生il-12p70。

5、即，基于一實施方式，本發(fā)明提供了一種恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞的制備方法，其包括：步驟(1)，將編碼c-myc的核酸導(dǎo)入髓樣細(xì)胞；步驟(2)，在gm-csf和m-csf的存在下培養(yǎng)由上述步驟(1)得到的細(xì)胞；以及步驟(3)，將編碼il-12p35亞基的核酸及編碼il-12p40亞基的核酸導(dǎo)入到由上述步驟(2)得到的細(xì)胞中。

6、上述方法優(yōu)選在上述步驟(1)中進(jìn)一步導(dǎo)入編碼bmi1的核酸以及編碼mdm2、lyl1或bcl2同種型α的核酸。

7、優(yōu)選地，上述髓樣細(xì)胞是從多能干細(xì)胞分化而成的。

8、另外，基于一實施方式，本發(fā)明還提供一種由上述方法制備的恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞。

9、另外，基于一實施方式，本發(fā)明還提供一種恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞，其包含編碼c-myc的外源性核酸、編碼il-12p35亞基的外源性核酸以及編碼il-12p40亞基的外源性核酸。

10、優(yōu)選地，上述細(xì)胞以gm-csf及m-csf依賴性方式增殖。

11、優(yōu)選地，上述細(xì)胞在沒有cd40-cd40配體相互作用或toll樣受體刺激的狀態(tài)下產(chǎn)生至少300pg/1×104個細(xì)胞/24小時的il-12p70。

12、優(yōu)選地，上述細(xì)胞與有toll樣受體刺激狀態(tài)下的單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞相比，產(chǎn)生至少5倍的il-12p70。

13、優(yōu)選地，上述細(xì)胞表達(dá)至少一種選自cd86、cd80及cd83的共刺激分子。

14、上述細(xì)胞可以不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類分子。

15、優(yōu)選地，上述細(xì)胞缺失主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類基因以及/或者編碼參與它們表達(dá)的因子的基因。

16、優(yōu)選地，上述細(xì)胞還包含編碼嵌合抗原受體的外源性核酸。

17、優(yōu)選地，上述細(xì)胞還缺失sirpα基因。

18、優(yōu)選地，上述細(xì)胞缺失內(nèi)源性的主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類基因以及/或者編碼參與它們表達(dá)的因子的基因，并且還包含編碼所期望的主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類的外源性核酸。

19、另外，基于一實施方式，本發(fā)明還提供一種包含上述細(xì)胞而成的用于激活t細(xì)胞和/或nk細(xì)胞的組合物。

20、優(yōu)選地，上述組合物誘導(dǎo)上述t細(xì)胞和/或nk細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ。

21、另外，基于一實施方式，本發(fā)明還提供一種包含上述細(xì)胞而成的用于預(yù)防或治療對象中的癌癥的藥物組合物。

22、另外，基于一實施方式，本發(fā)明還提供一種包括向上述對象施用上述細(xì)胞的步驟來用于預(yù)防或治療對象中的癌癥的方法。

23、優(yōu)選地，上述方法還包括向上述對象施用免疫檢查點抑制劑的步驟。

24、發(fā)明的效果

25、本發(fā)明的增殖性髓樣細(xì)胞與單核細(xì)胞來源的dc不同，不需要特別的刺激、誘導(dǎo)就能夠恒定且大量地產(chǎn)生il-12p70，并且通過與免疫檢查點抑制劑聯(lián)用而顯示協(xié)同的抗腫瘤效果。因此，本發(fā)明的增殖性髓樣細(xì)胞可以發(fā)揮比單核細(xì)胞來源的dc更高的癌癥治療效果。此外，本發(fā)明的增殖性髓樣細(xì)胞即使在不呈遞抗原的情況下也能夠激活t細(xì)胞、nk細(xì)胞，因此可以去除hla。因此，本發(fā)明的增殖性髓樣細(xì)胞針對用于癌癥治療的通用細(xì)胞制劑的開發(fā)是有用的。

技術(shù)特征：

1.一種恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞的制備方法，其包括：

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，在所述步驟(1)中進(jìn)一步導(dǎo)入編碼bmi1的核酸以及編碼mdm2、lyl1或bcl2同種型α的核酸。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述髓樣細(xì)胞是從多能干細(xì)胞分化而成的。

4.一種增殖性髓樣細(xì)胞，其由權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法制備且恒定地產(chǎn)生il-12p70。

5.一種恒定地產(chǎn)生il-12p70的增殖性髓樣細(xì)胞，其包含編碼c-myc的外源性核酸、編碼il-12p35亞基的外源性核酸以及編碼il-12p40亞基的外源性核酸。

6.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其以gm-csf及m-csf依賴性方式增殖。

7.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞在沒有cd40-cd40配體相互作用或無toll樣受體刺激的狀態(tài)下產(chǎn)生至少300pg/1×104個細(xì)胞/24小時的il-12p70。

8.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其中，與toll樣受體刺激狀態(tài)下單核細(xì)胞來源的樹突狀細(xì)胞相比，所述細(xì)胞產(chǎn)生至少5倍的il-12p70。

9.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其表達(dá)至少一種選自cd86、cd80及cd83的共刺激分子。

10.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類分子。

11.如權(quán)利要求10所述的細(xì)胞，其缺失主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類基因以及/或者編碼參與它們表達(dá)的因子的基因。

12.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其還包含編碼嵌合抗原受體的外源性核酸。

13.如權(quán)利要求11所述的細(xì)胞，其還缺失sirpα基因。

14.如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其缺失內(nèi)源性的主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類基因以及/或者編碼參與它們表達(dá)的因子的基因，并且還包含編碼所期望的主要組織相容性復(fù)合體i類和/或ii類的外源性核酸。

15.一種用于激活t細(xì)胞和/或nk細(xì)胞的組合物，其包含權(quán)利要求5至14中任一項所述的細(xì)胞。

16.如權(quán)利要求15的組合物，其誘導(dǎo)所述t細(xì)胞和/或nk細(xì)胞產(chǎn)生干擾素γ。

17.一種用于預(yù)防或治療對象中的癌癥的藥物組合物，其包含權(quán)利要求5至14中任一項所述的細(xì)胞。

18.一種用于預(yù)防或治療對象中的癌癥的方法，其包含向所述對象施用權(quán)利要求5至14中任一項所述細(xì)胞的步驟。

19.如權(quán)利要求18所述的方法，其還包括向所述對象施用免疫檢查點抑制劑的步驟。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種恒定地產(chǎn)生IL?12p70的增殖性髓樣細(xì)胞的制備方法，其包括：步驟(1)，將編碼c?MYC的核酸導(dǎo)入髓樣細(xì)胞；步驟(2)，在GM?CSF和M?CSF的存在下培養(yǎng)由上述步驟(1)得到的細(xì)胞；以及步驟(3)，將編碼IL?12p35亞基的核酸及編碼IL?12p40亞基的核酸導(dǎo)入到由上述步驟(2)得到的細(xì)胞中。

技術(shù)研發(fā)人員：植村靖史,福田恭子
受保護(hù)的技術(shù)使用者：北京天一方生物科技發(fā)展有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6