背景技術(shù)：

1、各種效應(yīng)因子(例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子)可用于調(diào)控細(xì)胞中靶基因的表達(dá)或活性。例如，可以向細(xì)胞引入(例如，遞送、表達(dá)等)異源基因效應(yīng)因子，并且異源基因效應(yīng)因子可以單獨(dú)或與額外的試劑一起實(shí)現(xiàn)對靶基因的此類調(diào)控。在一些實(shí)例中，額外的試劑可以包括成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(crispr)/crispr相關(guān)蛋白(cas)，用于特異性結(jié)合靶基因(例如，靶基因的靶標(biāo)脫氧核糖核酸(dna)序列或核糖核酸(rna)序列(例如，外源dna序列或rna序列))，而異源基因效應(yīng)因子可以調(diào)控靶基因的表達(dá)或活性水平。例如，可以使用此類基因效應(yīng)因子作為基因療法來治療或改善受試者的狀況(例如疾病)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、vp64-p65-rta融合多肽(vpr)是基準(zhǔn)基因效應(yīng)因子，其能夠激活細(xì)胞中的靶基因。然而，在一些情況下，vpr可能并非對調(diào)控所有基因而言是最佳的或足夠的?；蛘呋蛄硗?，vpr的大小(例如，約518個(gè)氨基酸殘基)可能不夠小，從而無法將它們與至少一種額外的試劑(例如，一個(gè)或多個(gè)引導(dǎo)rna、編碼治療性多核苷酸或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因、各種類型的cas酶等)一起包裝在遞送方式中(例如病毒載體，如腺相關(guān)病毒(aav)載體)。因此，例如，本公開的各個(gè)方面提供了工程化效應(yīng)因子、其組合物和其使用方法，所述工程化效應(yīng)因子與vpr不相同，但在激活一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)或活性水平方面與所述vpr具有可比的有效性。

2、krueppel相關(guān)盒(krab)是可以見于真核krueppel型c2h2鋅指蛋白(zfp)中的結(jié)構(gòu)域(例如，具有約75個(gè)氨基酸殘基或更少)。krab是基準(zhǔn)基因效應(yīng)因子，能夠阻抑細(xì)胞中的靶基因。然而，在一些情況下，所述krab可能并非對調(diào)控所有基因而言是最佳的或足夠的。因此，例如，本公開的各個(gè)方面提供了工程化效應(yīng)因子、其組合物和其使用方法，所述工程化效應(yīng)因子與krab不相同，但在降低一個(gè)或多個(gè)靶基因的表達(dá)或活性水平方面與所述krab具有可比的有效性。

3、本文公開了包含多肽的工程化基因效應(yīng)因子，其中：所述多肽對于選自于由vp16、vp64、p65和rta所組成的組中的成員中的任一個(gè)是異源的；所述工程化基因效應(yīng)因子的大小為至多約500個(gè)氨基酸殘基；并且工程化基因效應(yīng)因子能夠激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平，其中，與對照細(xì)胞中由vp64-p65-rta融合多肽(vpr)激活的表達(dá)水平相比，通過工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平為至少約80％。

4、本文公開了包含多肽的工程化基因效應(yīng)因子，所述多肽偶聯(lián)至額外的多肽，其中：所述多肽包含與seq?id?no:1的多肽序列具有至少約70％序列同一性的氨基酸序列；所述額外的多肽包含選自于由vp16、vp64、p65和rta所組成的組中的一個(gè)或多個(gè)成員的至少部分；并且工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約250個(gè)氨基酸殘基。

5、本文公開了包含多肽的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽包含與seq?id?no:1的多肽序列具有至少約70％序列同一性的氨基酸序列，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子與seq?id?no:2、seq?id?no:3和seq?id?no:4中的任一個(gè)不相同。

6、本文公開了工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子包含多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域，其中，所述多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域的各多肽結(jié)構(gòu)域都包含多肽，所述多肽包含表現(xiàn)出與seq?idno:1的多肽序列的至少約70％序列同一性的氨基酸序列。包含前述項(xiàng)權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子的系統(tǒng)。

7、本文公開了編碼本文所公開的系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。

8、本文公開了包含本文所公開的系統(tǒng)的細(xì)胞。

9、本文公開了控制細(xì)胞中靶基因的方法，所述方法包括使細(xì)胞與本文所公開的系統(tǒng)接觸。

10、本公開的其它方面和優(yōu)點(diǎn)對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將從以下詳細(xì)描述中很容易看到，其中僅顯示和描述了本公開的說明性實(shí)施方式。應(yīng)認(rèn)識到，本公開可以有其它不同的實(shí)施方式，并且其若干細(xì)節(jié)可以在各個(gè)明顯的方面進(jìn)行修改，所有這些都不背離本公開。因此，附圖和描述應(yīng)被視為說明性的，而不是限制性的。

11、引用并入

12、本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入本文，其程度與每篇單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾埦幻鞔_且單獨(dú)地指明通過引用并入相同。如果通過引用并入的出版物和專利或?qū)＠暾埮c本說明書中包含的公開內(nèi)容相矛盾，則本說明書旨在取代和/或優(yōu)先于任何此類矛盾材料。

技術(shù)特征：

1.一種工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子包含多肽，其中：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平是所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平的至少約90％。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平是所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平的至少約95％。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平是所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平的至少約100％。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平比所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平高至少約5％。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平比所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平高至少約10％。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，通過所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平持續(xù)至少約12天的持續(xù)時(shí)間。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，通過所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平持續(xù)至少約18天的持續(xù)時(shí)間。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平是所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平的至少約80％，并且所述表達(dá)水平持續(xù)至少約9天的持續(xù)時(shí)間。

10.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，由所述工程化基因效應(yīng)因子激活的靶基因的表達(dá)水平是所述對照細(xì)胞中由vpr激活的靶基因的表達(dá)水平的至少約90％，并且所述表達(dá)水平持續(xù)至少約12天的持續(xù)時(shí)間。

11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約400個(gè)氨基酸殘基。

12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約300個(gè)氨基酸殘基。

13.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約250個(gè)氨基酸殘基。

14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述靶基因?qū)τ诩?xì)胞是內(nèi)源的。

15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列表現(xiàn)出與seq?id?no:1的多肽序列的至少約70％序列同一性。

16.一種工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子包含多肽，所述多肽偶聯(lián)至額外的多肽，其中：

17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外的多肽包括vp16。

18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外的多肽包括vp64。

19.根據(jù)權(quán)利要求16-18中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子能夠激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平。

20.根據(jù)權(quán)利要求16-19中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽融合至所述額外的多肽。

21.根據(jù)權(quán)利要求16-20中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽與seqid?no:2和seq?id?no:3中的任一個(gè)不相同。

22.根據(jù)權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述至少部分包含與seq?id?no:5的多肽序列具有至少約70％序列同一性的氨基酸序列。

23.根據(jù)權(quán)利要求16-21中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述至少部分包含與seq?id?no:6的多肽序列具有至少約70％序列同一性的氨基酸序列。

24.根據(jù)權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外多肽位于所述多肽的c末端鄰近處。

25.根據(jù)權(quán)利要求16-23中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外多肽位于所述多肽的n末端鄰近處。

26.根據(jù)權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外多肽包含填充多肽序列。

27.根據(jù)權(quán)利要求16-26中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述額外多肽包含接頭序列。

28.一種工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子包含多肽，其中，所述多肽包含與seq?id?no:1的多肽序列具有至少約70％序列同一性的氨基酸序列，

29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子能夠激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平。

30.一種工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子包含多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域，其中，所述多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域的各多肽結(jié)構(gòu)域包含多肽，所述多肽包含表現(xiàn)出與seq?id?no:1的多肽序列的至少約70％序列同一性的氨基酸序列。

31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子能夠激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平。

32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域包含三個(gè)以上的多肽。

33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域包括相互偶聯(lián)的第一多肽結(jié)構(gòu)域和第二多肽結(jié)構(gòu)域。

34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述第一多肽結(jié)構(gòu)域融合至所述第二多肽結(jié)構(gòu)域。

35.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽的氨基酸序列表現(xiàn)出與seq?id?no:1的多肽序列的至少約80％序列同一性。

36.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽的氨基酸序列表現(xiàn)出與seq?id?no:1的多肽序列的至少約90％序列同一性。

37.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽的氨基酸序列表現(xiàn)出與seq?id?no:1的多肽序列的至少約95％序列同一性。

38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽的氨基酸序列的大小為至多約50個(gè)氨基酸殘基、至多約40個(gè)氨基酸殘基或至多約35個(gè)氨基酸殘基。

39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述多肽的氨基酸序列的大小為至少約20個(gè)氨基酸殘基、至少約25個(gè)氨基酸殘基或至少約30個(gè)氨基酸殘基。

40.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約150個(gè)氨基酸殘基。

41.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子的大小小于或等于約100個(gè)氨基酸殘基。

42.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，當(dāng)與seq?id?no:1的多肽序列對齊時(shí)，所述多肽的氨基酸序列包含選自于由c4、l5、m7和l19所組成的組中的一個(gè)或多個(gè)成員。

43.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子，其中，所述工程化基因效應(yīng)因子能夠激活細(xì)胞中靶基因的表達(dá)水平至少約9天。

44.一種系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的工程化基因效應(yīng)因子。

45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的系統(tǒng)，其中，所述系統(tǒng)包含所述工程化基因效應(yīng)因子，所述工程化基因效應(yīng)因子偶聯(lián)至異源核酸內(nèi)切酶。

46.根據(jù)權(quán)利要求44或45所述的系統(tǒng)，其中，所述異源核酸內(nèi)切酶是cas蛋白。

47.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)進(jìn)一步包含能夠形成復(fù)合體的引導(dǎo)核酸，所述復(fù)合體包含所述工程化基因效應(yīng)因子和所述異源核酸內(nèi)切酶，其中，所述復(fù)合體表現(xiàn)出對靶基因的特異性結(jié)合。

48.編碼前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸。

49.一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)。

50.一種控制細(xì)胞中靶基因的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞與前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)接觸。

51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述控制包括激活所述靶基因的表達(dá)水平。

52.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中，所述靶基因?qū)τ谒黾?xì)胞是內(nèi)源的。

技術(shù)總結(jié)
本公開提供了一種或多種工程化基因效應(yīng)因子及其系統(tǒng)、組合物和使用方法，其中，所述一種或多種工程化基因效應(yīng)因子可用于實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞中靶基因(例如，細(xì)胞中的內(nèi)源性靶基因)的調(diào)控。所述一種或多種工程化基因效應(yīng)因子可以可操作地偶聯(lián)至異源核酸內(nèi)切酶，例如CRISPR/Cas蛋白。

技術(shù)研發(fā)人員：喬瓦尼·卡羅索,亓磊,丹尼爾·O·哈特,羅賓·W·約,蒂莫西·戴利,穆罕默德·扎基·賈瓦德
受保護(hù)的技術(shù)使用者：埃皮克里斯皮爾生物技術(shù)公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6