本發(fā)明的領(lǐng)域是用于基于細(xì)胞的治療的組合物和方法，并且尤其是當(dāng)其涉及具有增強(qiáng)的細(xì)胞毒性的nk細(xì)胞，這些nk細(xì)胞天然表達(dá)cd16和cd57。

背景技術(shù)：

1、背景描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。并不承認(rèn)本文提供的任何信息是現(xiàn)有技術(shù)或與當(dāng)前要求保護(hù)的發(fā)明相關(guān)，也不承認(rèn)特別地或隱含地引用的任何出版物是現(xiàn)有技術(shù)。

2、本文中的所有出版物和專利申請(qǐng)都通過(guò)引用并入，其程度如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特別地且單獨(dú)地指明通過(guò)引用并入一樣。如果并入的參考文獻(xiàn)中術(shù)語(yǔ)的定義或使用與本文提供的該術(shù)語(yǔ)的定義不一致或相悖，則本文提供的該術(shù)語(yǔ)的定義適用，而參考文獻(xiàn)中該術(shù)語(yǔ)的定義不適用。

3、自然殺傷(nk)細(xì)胞構(gòu)成一組先天免疫細(xì)胞，其常常表征為經(jīng)由顆粒溶素和穿孔素的靶標(biāo)定向釋放而表現(xiàn)出抗體依賴性細(xì)胞毒性的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。盡管最近nk細(xì)胞已經(jīng)成為某些癌癥治療的重要組成部分，但是由于全血中nk細(xì)胞的比例相對(duì)較低，因此生成治療上有意義數(shù)量的nk細(xì)胞(尤其是自體nk細(xì)胞)仍然非常困難。

4、為了獲得治療上有意義數(shù)量的nk細(xì)胞和nk樣細(xì)胞，可以從各種前體細(xì)胞生成nk細(xì)胞。例如，各種干細(xì)胞因子(scf)、flt3配體、白細(xì)胞介素(il)-2、il-7和il-15已經(jīng)在各種體外誘導(dǎo)和擴(kuò)增臍帶血來(lái)源的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cik)細(xì)胞的方法中進(jìn)行了報(bào)道(anticancer?research[抗癌研究]30:3493-3500(2010))。類似地，cd34+造血細(xì)胞可以暴露于il-12和其他藥劑，如us2018/0044636中所報(bào)道的。在其他方法中，人成血管細(xì)胞順序暴露于兩種不同的細(xì)胞因子混合物，如wo?2011/068896中所述，并且不同的細(xì)胞因子混合物與胚胎后造血干細(xì)胞一起使用，如wo?2012/128622中所教導(dǎo)的。盡管這些方法中的至少一些提供了nk細(xì)胞的顯著n倍擴(kuò)增，但用于這樣的擴(kuò)增的方法和試劑既需要時(shí)間又需要資源。更進(jìn)一步地，應(yīng)指出，許多已知的方法還需要在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)nk細(xì)胞，這從技術(shù)和監(jiān)管角度來(lái)看常常是有問(wèn)題的。

5、為了避免與從前體細(xì)胞或經(jīng)分離的nk細(xì)胞生成治療量的nk細(xì)胞相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題，可以采用nk-92細(xì)胞系。nk-92細(xì)胞是白介素-2(il-2)依賴性自然殺傷細(xì)胞，其源自患有快速進(jìn)展的非霍奇金淋巴瘤的50歲白人男性的外周血單核細(xì)胞，并且可以從atcc以crl-2407商購(gòu)獲得。有利的是，nk-92細(xì)胞可以大規(guī)模生長(zhǎng)，并且自然殺傷細(xì)胞系nk-92有效殺傷范圍廣泛的惡性細(xì)胞的能力使得其適合用于癌癥的細(xì)胞免疫療法。然而，nk-92細(xì)胞系的細(xì)胞通常不表達(dá)cd16，因此缺乏與靶向抗體結(jié)合以實(shí)現(xiàn)靶特異性細(xì)胞毒性(并且尤其是抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc))的能力。

6、最近，產(chǎn)生了從轉(zhuǎn)染到nk細(xì)胞中的重組核酸表達(dá)cd16的nk細(xì)胞，如例如us2019/0321402中所描述的。遺憾的是，在nk細(xì)胞擴(kuò)增以獲得大量nk細(xì)胞用于治療的過(guò)程中，這樣的基于rna的表達(dá)通常不會(huì)在多代內(nèi)保持穩(wěn)定。在替代性方法中，如wo?2020/1504752018中所描述的，在nk-92細(xì)胞系上使用facs分選策略來(lái)選擇具有內(nèi)源cd16表達(dá)的nk細(xì)胞(還參見(jiàn)：zih-fei?cheng(2021)biochemistry?and?biophysics?reports[生物化學(xué)和生物物理學(xué)報(bào)告]第26卷)。在此，建立了人nk-92來(lái)源的細(xì)胞系onk-1，其內(nèi)源表達(dá)cd16，以及親本nk-92細(xì)胞系所特有的高水平的nk活化標(biāo)志物和低水平的nk抑制標(biāo)志物。

7、有趣的是，當(dāng)這些細(xì)胞與單克隆抗體曲妥珠單抗共價(jià)綴合時(shí)，與體外對(duì)照onk細(xì)胞相比，如此修飾的細(xì)胞對(duì)具有1級(jí)(mcf-7)、2級(jí)(ovcar-3)和3級(jí)(sk-ov-3)her2表達(dá)的各種類型的癌細(xì)胞表現(xiàn)出人表皮生長(zhǎng)因子2(her2)結(jié)合特異性和增強(qiáng)的細(xì)胞毒性(參見(jiàn)例如，proceedings?ofthe?annual?meeting?ofthe?american?association?forcancerresearch2020[2020年美國(guó)癌癥研究協(xié)會(huì)年會(huì)論文集]；2020年4月27-28日和6月22-24日.費(fèi)城(philadelphia(pa)):aacr；cancerres[癌癥研究]2020；80(16增刊):摘要編號(hào)2169)。遺憾的是，在onk細(xì)胞中進(jìn)行生產(chǎn)和cd16表達(dá)需要非常高量的il-2(500單位/ml)。

8、nk-92mi(atcc：crl-2408)是nk-92的il-2非依賴性變體，其是使用hil-2cdna的顆粒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移制備的。nk-92mi細(xì)胞對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞顯示出有效的細(xì)胞毒性。然而，通常介導(dǎo)adcc的fc受體(cd16)在nk-92mi細(xì)胞上完全缺失或僅以非常低的水平存在，并且這些細(xì)胞將因此不能誘導(dǎo)用于靶特異性細(xì)胞殺傷的adcc。雖然已經(jīng)證明，如果循環(huán)nk細(xì)胞也是cd57陽(yáng)性的，則cd16介導(dǎo)的adcc活性更有效(參見(jiàn)例如，sandra?lopez-vergès(2010)blood[血液]2010116(19))，但是血液中cd16+cd57+細(xì)胞的比例非常低，因?yàn)檫@些細(xì)胞代表成熟nk細(xì)胞。因此，尚未富集和增殖至治療上有意義的數(shù)量。還生成了nk-92mi嵌合細(xì)胞，以使用病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)表達(dá)可以結(jié)合人免疫球蛋白的fc部分的重組嵌合受體(參見(jiàn)例如，yingchen(2017)oncotarget[腫瘤靶標(biāo)]6；8(23))。然而，這些細(xì)胞的cd57表達(dá)既沒(méi)有報(bào)道也沒(méi)有合理的預(yù)期。

9、因此，盡管nk細(xì)胞療法的各種組合物和方法在本領(lǐng)域中是已知的，但它們?nèi)炕驇缀跞慷季哂袔讉€(gè)缺點(diǎn)，特別是在以經(jīng)濟(jì)方式需要大量這樣的細(xì)胞的情況下，以及在這樣的細(xì)胞表達(dá)cd16和cd57以增強(qiáng)細(xì)胞毒性的情況下。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明主題涉及各種細(xì)胞和基于細(xì)胞的組合物及其方法，其中細(xì)胞是天然表達(dá)cd16和cd57并且表現(xiàn)出il-2非依賴性生長(zhǎng)的cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞。最值得注意的是，這樣的細(xì)胞具有顯著增強(qiáng)的細(xì)胞毒性并且可以以簡(jiǎn)單且具成本效益的方式進(jìn)行生產(chǎn)。

2、在本發(fā)明主題的一個(gè)方面，諸位發(fā)明人設(shè)想的是一種cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞，該細(xì)胞天然表達(dá)cd16和cd57并且表現(xiàn)出il-2非依賴性生長(zhǎng)。最通常地，cd16是cd16a或cd16b。與親本nk-92mi細(xì)胞(atcc：crl-2408)相比，尤其設(shè)想的細(xì)胞以更高的量表達(dá)nkg2d。此外，cd3通常不存在于該細(xì)胞的表面上，而cd56通常存在于該細(xì)胞的表面上。此外，本文提出的細(xì)胞可以在細(xì)胞的表面上進(jìn)一步包括以下中的一種或多種：cd4、cd25、nkp30、nkp44、nkp46、cd27、ox40、cd107a、nkg2a、pd-1、tigit。

3、在表型上，本文提出的細(xì)胞與親本nk-92mi細(xì)胞(atcc：crl-2408)相比一般將對(duì)ramos細(xì)胞具有增強(qiáng)的直接細(xì)胞毒性，和/或本文提出的細(xì)胞在靶細(xì)胞和抗靶細(xì)胞上的表面蛋白的抗體存在下表現(xiàn)出強(qiáng)adcc。此外，與親本nk-92mi細(xì)胞(atcc：crl-2408)相比，所設(shè)想的細(xì)胞在解凍和擴(kuò)增后還將具有高水平的cd57、cd16和nkg2d表達(dá)。更進(jìn)一步地，在至少一些實(shí)施例中，與親本nk-92mi細(xì)胞(atcc：crl-2408)相比，這些細(xì)胞在脫顆粒后將具有更快的補(bǔ)充、和/或更快的細(xì)胞倍增時(shí)間。

4、在需要的情況下，cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞還可以用編碼嵌合抗原受體、歸巢受體、趨化因子受體、tgf-β陷阱(tgf-βtrap)和/或檢查點(diǎn)抑制劑的重組核酸來(lái)轉(zhuǎn)染?？商娲?，或者另外地，cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞還可以具有與細(xì)胞的表面結(jié)合的抗體或抗體片段(例如，經(jīng)由cd16或接頭)。

5、在本發(fā)明主題的另一個(gè)方面，諸位發(fā)明人還設(shè)想了一種組合物，該組合物包含在培養(yǎng)基中的多個(gè)如本文所提出的nk-92mi細(xì)胞，其中至少10％、或至少50％、或至少90％的nk-92mi細(xì)胞是天然表達(dá)cd16和cd57并且表現(xiàn)出il-2非依賴性生長(zhǎng)的cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞。如將理解的，所設(shè)想的培養(yǎng)基包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基、冷凍保存培養(yǎng)基和用于輸注的藥學(xué)上可接受的培養(yǎng)基。此外，組合物可以進(jìn)一步包含抗體，該抗體可以或可以不與cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞的cd16結(jié)合。在進(jìn)一步設(shè)想的方面，多個(gè)細(xì)胞是在1×108至1×1010個(gè)細(xì)胞之間，培養(yǎng)基是用于輸注的藥學(xué)上可接受的培養(yǎng)基，并且細(xì)胞和培養(yǎng)基放置在聚合物袋中。

6、在本發(fā)明主題的另外的方面，諸位發(fā)明人設(shè)想的是包含在培養(yǎng)基中的多個(gè)分裂細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物，其中這些細(xì)胞是如本文所提出的cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞，其中該培養(yǎng)基基本上不含il-2。在通常的實(shí)施例中，多個(gè)分裂細(xì)胞優(yōu)選從培養(yǎng)開(kāi)始和在生長(zhǎng)期間被維持在單個(gè)培養(yǎng)容器中，直到獲得預(yù)定量的細(xì)胞。因此，所設(shè)想的細(xì)胞培養(yǎng)物可以含有至少1×107個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)容器。最通常地，但非必須的是，培養(yǎng)基含有人ab血清或者是無(wú)血清培養(yǎng)基。

7、在本發(fā)明主題的仍另外的方面，諸位發(fā)明人設(shè)想的是一種制備天然表達(dá)cd16和cd57并且表現(xiàn)出il-2非依賴性生長(zhǎng)的cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞的方法。這樣的方法通常包括提供多個(gè)nk-92mi細(xì)胞的步驟，以及使用抗cd16抗體和抗cd57抗體富集天然表達(dá)cd16和cd57的cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞的另一個(gè)步驟。

8、例如，抗cd16抗體和抗cd57抗體中的每一種都可以是熒光標(biāo)記的，并且可以將抗體用于(通常是按順序的)使用熒光激活細(xì)胞分選(facs)進(jìn)行的富集。如將容易理解的，可以使用單次通過(guò)分選(single?pass?sorting)或使用迭代輪次的facs來(lái)進(jìn)行facs。此外，所設(shè)想的方法還可以包括對(duì)cd16+cd57+nk-92mi細(xì)胞的富集群體進(jìn)行擴(kuò)增的步驟。

9、在本發(fā)明主題的又另一個(gè)方面，諸位發(fā)明人設(shè)想的是一種治療癌癥的方法，該方法包括向有需要的個(gè)體施用治療有效量的如本文所提出的細(xì)胞或者包含這樣的細(xì)胞的組合物的步驟。最通常地，個(gè)體是哺乳動(dòng)物(例如，人)，和/或癌癥是實(shí)體癌。如將容易理解的，通過(guò)輸注施用細(xì)胞或組合物，并且治療還可以包括共同施用抗體、檢查點(diǎn)抑制劑、免疫刺激劑和/或癌癥疫苗的步驟。

10、根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例的以下詳細(xì)描述以及附圖(其中相同的數(shù)字代表相同的組分)，本發(fā)明主題的各種目的、特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚。