本公開涉及生物，具體涉及一種去除非目標(biāo)核酸模板的方法。

背景技術(shù)：

1、在pcr擴(kuò)增過程中，pcr產(chǎn)物片段會(huì)通過氣溶膠彌散在環(huán)境中，在進(jìn)行第二次擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些氣溶膠的片段就會(huì)當(dāng)成模板被擴(kuò)增出來，最終會(huì)造成假陽性擴(kuò)增的結(jié)果。

2、目前主要用來防止氣溶膠污染的方法是dutp和udg酶(uracil?dna?glycosylase，尿嘧啶dna糖基酶)結(jié)合的方式，例如美國專利us7687247b1中公開的方法。但是，由于udg對du的切割，只是對一條鏈的切刻，在使用較低的dutp進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的氣溶膠，經(jīng)過udg處理后仍然能被擴(kuò)增出來。特別地，在tngs(targetednext?generation?sequencing，靶向下一代測序，例如病原微生物靶向測序)超多重pcr中，添加dutp的量不能太多，否則會(huì)影響多重?cái)U(kuò)增的性能，而添加較少的dutp會(huì)導(dǎo)致在tngs的多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)物上du的比例較少，在udg進(jìn)行切割之后的片段，會(huì)在擴(kuò)增中通過正負(fù)鏈互搭的方式經(jīng)過幾輪pcr擴(kuò)增會(huì)修復(fù)成一個(gè)完整的模板，從而導(dǎo)致氣溶膠污染的模板被擴(kuò)增出來。也就是說，udg酶并不能進(jìn)行徹底清除含du的產(chǎn)物，增加udg酶的使用量仍然不能徹底清除。進(jìn)而，在做tngs測序中，仍然能檢測到來自氣溶膠污染造成的假陽性的結(jié)果。因此當(dāng)前的dutp結(jié)合udg酶的方法還不能真正地防止氣溶膠污染。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開的目的在于提供一種去除非目標(biāo)核酸模板的方法，包括du/di介導(dǎo)的雙鏈dna斷裂法(簡稱udb/idb)(圖1)和du/di介導(dǎo)的雙鏈dna外切法(簡稱ude/ide)(圖2)。本公開提供的方法可以在不影響擴(kuò)增的前提下，實(shí)現(xiàn)對非目標(biāo)核酸模板(污染片段)的徹底清除的目的，并且，這種方法不僅可以應(yīng)用到常規(guī)的pcr擴(kuò)增和qpcr擴(kuò)增中，還能夠運(yùn)用到tngs中的多重?cái)U(kuò)增中，保證每一次結(jié)果的保真性。

2、本公開的第一方面提供一種去除非目標(biāo)核酸模板的方法，所述方法包括：向包含目標(biāo)核酸模板和非目標(biāo)核酸模板的反應(yīng)體系中加入消化酶組合，并孵育；所述消化酶組合包括dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶，或，所述消化酶組合包括dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶；所述非目標(biāo)核酸模板中含有du(脫氧尿苷)或di(脫氧肌苷)中的至少一種，所述目標(biāo)模板中不含有du或di。例如，非目標(biāo)核酸模板中含有du，目標(biāo)核酸模板中不含du，無論非目標(biāo)核酸模板和目標(biāo)核酸模板是否含有di；或者，非目標(biāo)核酸模板中含有di，目標(biāo)核酸模板中不含di，無論非目標(biāo)核酸模板和目標(biāo)核酸模板是否含有du。又例如，非目標(biāo)核酸模板中含有du且不含di，目標(biāo)核酸模板中不含du，無論目標(biāo)核酸模板是否含有di；非目標(biāo)核酸模板中含有di且不含du，目標(biāo)核酸模板中不含di，無論目標(biāo)核酸模板是否含有du；或者，非目標(biāo)核酸模板中含有du且含有di，目標(biāo)核酸模板中不含du且/或不含di。

3、在一些實(shí)施方案中，所述非目標(biāo)核酸模板包含雙鏈核酸。在一些實(shí)施方案中，所述非目標(biāo)核酸模板包含雙鏈dna，所述雙鏈dna至少部分互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中至少一條鏈含有du和/或di。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中僅一條鏈含有du和/或di。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中兩條鏈均含有du和/或di。

4、在一些實(shí)施方案中，所述非目標(biāo)核酸模板來自環(huán)境，例如氣溶膠，例如測序室。

5、在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)體系是例如pcr擴(kuò)增體系或等溫?cái)U(kuò)增體系。

6、在一些實(shí)施方案中，所述dna糖基化酶特異性識別du或di位點(diǎn)并產(chǎn)生無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)(即ap位點(diǎn))。

7、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil?dnaglycosylase，udg酶)或單鏈選擇性單功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand?selective?monofunctional?uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特異性識別du位點(diǎn)并切除尿嘧啶(uracil，du)從而產(chǎn)生無嘧啶位點(diǎn)。

8、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine?dna?glycosylase，aag酶)或者內(nèi)切酶ⅴ(endonuclease?v)，所述aag酶或者內(nèi)切酶ⅴ特異性識別di位點(diǎn)并切除次黃嘌呤(hypoxanthine，di)從而產(chǎn)生無嘌呤位點(diǎn)。

9、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du和di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶可以是分別識別du和di位點(diǎn)的兩種酶，包括但不限于前述列舉的dna糖基化酶的任意組合，例如udg酶和aag酶。

10、在一些實(shí)施方案中，ap位點(diǎn)是指無嘌呤/無嘧啶位點(diǎn)，缺刻是指損傷的核酸鏈上斷裂一個(gè)磷酸二酯鍵，缺口是指損傷的核酸鏈上丟失一個(gè)或幾個(gè)核苷酸。

11、在一些實(shí)施方案中，所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶可以識別ap位點(diǎn)并切斷磷酸二酯鍵，形成缺刻或1個(gè)堿基的缺口。所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶是例如ape1(人源脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶，apurinic-apyrimidinicendonuclease?1)，內(nèi)切酶iii(endonuclease?iii)，內(nèi)切酶iv(endonuclease?iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna?glycosylase)，內(nèi)切酶v(endonuclease?v)，內(nèi)切酶viii(endonuclease?viii)，ogg1(8-氧代鳥嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo?guanine?dna?glycosylase?1)，t4?pdg(t4嘧啶二聚體糖基化酶，t4?pyrimidine?dna?glycosylase)，hneil1(human?endonuclease?viii-like1)，hnthl1(human?nth?like?dnaglycosylase?1)中的至少一種。

12、在一些實(shí)施方案中，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶可以對缺刻位點(diǎn)的dna進(jìn)行切割形成雙鏈dna斷裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶是例如t7內(nèi)切酶i(t7?endonuclease?i)和錯(cuò)配內(nèi)切酶i(mismatch?endonuclease?i)中的至少一種。

13、在一些實(shí)施方案中，所述dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶組成的消化酶組合將污染的dna模板切割成雙鏈斷裂(圖1)。

14、在一些實(shí)施方案中，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是特異性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能選擇性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的雙鏈dna；優(yōu)選地，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda?exonuclease)。

15、在一些實(shí)施方案中，所述dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶組成的消化酶組合將污染的dna模板沿5′→3′方向消化(圖2)。

16、在一些實(shí)施方案中，所述孵育條件是30-40℃處理5-20分鐘，例如30-38℃處理5-15分鐘，例如32-37℃處理5-15分鐘，例如35-37℃處理5-15分鐘，例如35-37℃處理5-10分鐘，例如37℃處理5-10分鐘，例如37℃處理8-10分鐘，例如37℃處理10分鐘。

17、在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括使消化酶組合失活的步驟，例如高溫處理或加入變性劑，例如93-98℃高溫處理1-5分鐘，例如95℃處理2-3分鐘。在一些實(shí)施方案中，所述高溫處理可以單獨(dú)進(jìn)行或在pcr擴(kuò)增中的高溫變性時(shí)進(jìn)行。

18、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i。

19、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶。

20、在一些實(shí)施方案中，本公開中的dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶分別指，含有dna糖基化酶活性、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶活性和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶活性的消化酶。當(dāng)某種消化酶含有兩種以上前述活性時(shí)，所述消化酶組合可以是一種、兩種或三種酶，例如內(nèi)切酶v既含有識別di并將其切割成無嘌呤位點(diǎn)的活性，又能夠識別無嘌呤位點(diǎn)并切割形成一個(gè)缺刻位點(diǎn)，例如所述消化酶組合可以是內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i。

21、在一些實(shí)施方案中，本公開中的dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶分別指，含有dna糖基化酶活性、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶活性和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶活性的消化酶。當(dāng)某種消化酶含有兩種以上前述活性時(shí)，所述消化酶組合可以是一種、兩種或三種酶，例如內(nèi)切酶v既含有識別di并將其切割成無嘌呤位點(diǎn)的活性，又能夠識別無嘌呤位點(diǎn)并切割形成一個(gè)缺刻位點(diǎn)，例如所述消化酶組合可以是內(nèi)切酶v和λ核酸外切酶。

22、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶的組合可以是任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合，包括但不限于前述部分列舉的消化酶組合。

23、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合包含至少1u的dna糖基化酶，5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和0.8u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，所述消化酶組合包含至少1u的dna糖基化酶，2.5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶，例如對于每ng?dna模板。

24、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合包含至少1u的dna糖基化酶，5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和1u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，所述消化酶組合包含至少2u的dna糖基化酶，5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和10u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶，例如對于每ng?dna模板。

25、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合包含至多4u的dna糖基化酶，20u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和10u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，所述消化酶組合包含至多4u的dna糖基化酶，10u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和40u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶，例如對于每ng?dna模板。

26、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合包含至多2u的dna糖基化酶，10u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，所述消化酶組合包含至多2u的dna糖基化酶，5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和20u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶，例如對于每ng?dna模板。

27、在一些實(shí)施方案中，本公開中消化酶組合的使用量相對于非目標(biāo)核酸模板是過量的。在一些實(shí)施方案中，消化酶組合中的每一種酶的過量獨(dú)立是其上述推薦用量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

28、本公開的第二方面提供一種pcr擴(kuò)增中去除非目標(biāo)核酸模板的方法，所述方法包括：

29、(1)配制含有目標(biāo)核酸模板和非目標(biāo)核酸模板的pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，所述反應(yīng)體系還包括：dna聚合酶，引物，緩沖物質(zhì)、金屬鹽、dntp和消化酶組合混合，所述dntp包括datp、dgtp、dctp和dttp，還包括dutp(脫氧尿苷三磷酸)和ditp(脫氧肌苷三磷酸)中的至少一種；所述消化酶組合包括dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶，或，所述消化酶組合包括dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶；所述非目標(biāo)核酸模板中含有du(脫氧尿苷)或di(脫氧肌苷)中的至少一種，所述目標(biāo)核酸模板中不含有du或di；

30、(2)孵育；

31、(3)在合適的條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

32、在一些實(shí)施方案中，所述非目標(biāo)核酸模板包含雙鏈dna。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna至少部分互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中至少一條鏈含有du和/或di。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中僅一條鏈含有du和/或di。在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈dna中兩條鏈均含有du和/或di。

33、在一些實(shí)施方案中，非目標(biāo)核酸模板中含有du，目標(biāo)核酸模板中不含du，無論非目標(biāo)核酸模板和目標(biāo)核酸模板是否含有di；或者，非目標(biāo)核酸模板中含有di，目標(biāo)核酸模板中不含di，無論非目標(biāo)核酸模板和目標(biāo)核酸模板是否含有du。在一些實(shí)施方案中，非目標(biāo)核酸模板中含有du且不含di，目標(biāo)核酸模板中不含du，無論目標(biāo)核酸模板是否含有di；非目標(biāo)核酸模板中含有di且不含du，目標(biāo)核酸模板中不含di，無論目標(biāo)核酸模板是否含有du；或者，非目標(biāo)核酸模板中含有du且含有di，目標(biāo)核酸模板中不含du且/或不含di。

34、在一些實(shí)施方案中，所述非目標(biāo)核酸模板來自環(huán)境，例如氣溶膠，例如測序室。

35、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil?dnaglycosylase，udg酶)或單鏈選擇性單功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand?selective?monofunctional?uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特異性識別du位點(diǎn)并切除尿嘧啶(uracil，du)從而產(chǎn)生無嘧啶位點(diǎn)。

36、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine?dna?glycosylase，aag酶)或者內(nèi)切酶ⅴ(endonuclease?v)，所述aag酶或者內(nèi)切酶ⅴ特異性識別di位點(diǎn)并切除次黃嘌呤(hypoxanthine，di)從而產(chǎn)生無嘌呤位點(diǎn)。

37、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du和di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶可以是分別識別du和di位點(diǎn)的兩種酶，包括但不限于前述列舉的dna糖基化酶的任意組合，例如udg酶和aag酶。

38、在一些實(shí)施方案中，所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶可以識別ap位點(diǎn)并切斷磷酸二酯鍵，形成缺刻或1個(gè)堿基的缺口。所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶是例如ape1(人源脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶，apurinic-apyrimidinic?endonuclease?1)，內(nèi)切酶iii(endonuclease?iii)，內(nèi)切酶iv(endonuclease?iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna?glycosylase)，內(nèi)切酶v(endonuclease?v)，內(nèi)切酶viii(endonuclease?viii)，ogg1(8-氧代鳥嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo?guanine?dna?glycosylase?1)，t4?pdg(t4嘧啶二聚體糖基化酶，t4?pyrimidine?dna?glycosylase)，hneil1(human?endonuclease?viii-like1)，hnthl1(human?nth?like?dnaglycosylase?1)中的至少一種。

39、在一些實(shí)施方案中，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶可以對缺刻位點(diǎn)的dna進(jìn)行切割形成雙鏈dna斷裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶是例如t7內(nèi)切酶i(t7?endonuclease?i)和錯(cuò)配內(nèi)切酶i(mismatch?endonuclease?i)中的至少一種。

40、在一些實(shí)施方案中，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是特異性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能選擇性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的雙鏈dna；優(yōu)選地，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda?exonuclease)。

41、在一些實(shí)施方案中，所述dutp/dttp＝1/n或所述ditp/dgtp＝1/n，所述n是大于零的常數(shù)，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；優(yōu)選地，所述n是大于等于1的常數(shù)；更優(yōu)選地，所述n是大于等于3的常數(shù)；最優(yōu)選地，所述n是大于等于5的常數(shù)。任選地，n小于1000或999、500或499、100或99、50或49、25或24、10或9、5或4。

42、在一些實(shí)施方案中，所述dna聚合酶是耐熱dna聚合酶，優(yōu)選taq?dna聚合酶。在一些實(shí)施方案中，所述dna聚合酶是兼容dutp和/或ditp底物的dna聚合酶。

43、在一些實(shí)施方案中，所述引物包含至少一對上游引物和下游引物。

44、在一些實(shí)施方案中，所述金屬鹽包括mg2+鹽、k+鹽、mn2+鹽、na+鹽、co2+鹽和ca2+鹽中的一種或多種。

45、在一些實(shí)施方案中，所述緩沖物質(zhì)包括tris、tris-hcl、tris堿或hepes中的一種或多種。

46、在一些實(shí)施方案中，所述步驟(2)的孵育條件是30-40℃處理5-20分鐘，例如30-38℃處理5-15分鐘，例如32-37℃處理5-15分鐘，例如35-37℃處理5-15分鐘，例如35-37℃處理5-10分鐘，例如37℃處理5-10分鐘，例如37℃處理8-10分鐘，例如37℃處理10分鐘。

47、在一些實(shí)施方案中，所述步驟(3)的擴(kuò)增反應(yīng)包括變性、退火和延伸的步驟；優(yōu)選包括預(yù)變性、變性、退火、延伸、徹底延伸。

48、在一些實(shí)施方案中，所述預(yù)變性和/或預(yù)變性為95℃高溫變性，所述消化酶在高溫下變性失活。

49、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i。

50、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶。

51、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶的組合可以是任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合，包括但不限于前述部分列舉的消化酶組合。

52、在一些實(shí)施方案中，所述目標(biāo)核酸模板是dna模板。

53、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和0.8u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和1u的缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶。

54、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和0.8u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的dna糖基化酶、2.5u的ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5u的5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶。

55、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的smug酶，5u的內(nèi)切酶iv和0.8u的錯(cuò)配內(nèi)切酶i；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的smug酶，5u的內(nèi)切酶iv和1u的錯(cuò)配內(nèi)切酶i。

56、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的udg酶，5u的ape1酶和0.8u的t7內(nèi)切酶i；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的udg酶，5u的ape1酶和1u的t7內(nèi)切酶i。

57、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的udg酶，2.5u的內(nèi)切酶iii和5u的λ核酸外切酶；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少2u的udg酶，5u的內(nèi)切酶iii和10u的λ核酸外切酶。

58、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少1u的smug酶，2.5u的內(nèi)切酶viii和5u的λ核酸外切酶；優(yōu)選地，所述消化酶組合的使用量為每ng?dna模板使用至少2u的smug酶，5u的內(nèi)切酶viii和10u的λ核酸外切酶。

59、在一個(gè)實(shí)施方案中，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合以0.5-1.5u:3-7u:0.5-10u，例如0.75-1.25u:4-6u:0.7-5u，例如0.9-1.1u:4.5-5.5u:0.6-2u，例如1u:5u:0.8-1u的比例提供。

60、在一個(gè)實(shí)施方案中，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合以0.5-1.5u:1.5-3.5u:3-7u，例如0.75-1.25u:2-3u:4-6u，例如1u:2.5u:5u的比例提供。

61、在一些實(shí)施方案中，本公開中消化酶組合的使用量相對于非目標(biāo)核酸模板是過量的。在一些實(shí)施方案中，消化酶組合中的每一種酶的過量獨(dú)立是其上述推薦用量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

62、在一些實(shí)施方案中，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系還包括探針和/或熒光染料，例如taqman熒光探針和/或sybr?green熒光染料。

63、本公開的第三方面提供一種擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括：

64、(1)獲得待測dna樣本作為目標(biāo)核酸模板，獲得擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的特異性引物對作為引物；

65、(2)使用第二方面所述的方法進(jìn)行pcr擴(kuò)增；

66、(3)任選地，純化或不純化擴(kuò)增產(chǎn)物；

67、(4)加入帶有測序接頭序列的引物，通過pcr擴(kuò)增得到帶有接頭的核酸片段；

68、(5)任選地，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。

69、在一些實(shí)施方案中，所述擴(kuò)增目標(biāo)區(qū)域的特異性引物對包含至少一對上游引物和下游引物。

70、在一些實(shí)施方案中，所述帶有測序接頭序列的引物包括帶有第一接頭序列的第一引物和帶有第二接頭序列的第二引物。

71、在一些實(shí)施方案中，所述接頭序列是當(dāng)前或?qū)頊y序平臺(包括但不限于iontorrent平臺、illumina平臺和華大平臺)使用的測序基質(zhì)相關(guān)序列。

72、在一些實(shí)施方案中，所述第一接頭序列是illumina平臺的p5接頭序列，所述第二接頭序列是illumina平臺的p7接頭序列，反之亦然。

73、在一些實(shí)施方案中，所述第一接頭序列是ion?torrent平臺的p1銜接頭序列，所述第二接頭序列是ion?torrent平臺的a銜接頭，反之亦然。

74、在一些實(shí)施方案中，所述第一接頭序列是mgi平臺的單端標(biāo)簽建庫上游夾板序列，所述第二接頭序列是mgi平臺的單端標(biāo)簽建庫下游夾板序列，反之亦然。在一些實(shí)施方案中，所述第一接頭序列是mgi平臺的雙端標(biāo)簽建庫上游夾板序列，所述第二接頭序列是mgi平臺的雙端標(biāo)簽建庫下游夾板序列，反之亦然。

75、在一些實(shí)施方案中，所述帶有測序接頭序列的引物還包括索引序列(index)。在一些實(shí)施方案中，所述索引序列為例如6-8個(gè)堿基，優(yōu)選8個(gè)。

76、在一些實(shí)施方案中，所述第一引物是n5引物，所述第二引物是n7引物，反之亦然。

77、在一些實(shí)施方案中，所述純化步驟中采用磁珠法、高鹽沉淀法、離心柱法或酚氯仿抽提法，優(yōu)選磁珠法。

78、本公開的第四方面提供一種病原菌靶向測序文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括：

79、(1)獲得待測dna樣本作為目標(biāo)核酸模板，所述dna樣本來自宿主和病原微生物；獲得擴(kuò)增目標(biāo)病原微生物目標(biāo)區(qū)域的特異性引物對作為引物；

80、(2)使用第三方面所述的方法進(jìn)行文庫構(gòu)建。

81、在一些實(shí)施方案中，所述宿主是例如人，所述病原微生物是例如真菌、細(xì)菌、病毒、螺旋體、支原體、立克次體、衣原體、朊毒體和寄生蟲中的一種或多種。

82、本公開的第五方面提供一種基于tngs檢測病原微生物的方法，所述方法包括：

83、(1)使用第四方面的方法進(jìn)行文庫構(gòu)建；

84、(2)上機(jī)測序。

85、本公開的第六方面提供第一方面和第二方面所述的方法在核酸擴(kuò)增防污染中的應(yīng)用。

86、本公開的第七方面提供一種試劑盒，其用于實(shí)施第一方面和第二方面所述的方法。

87、在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的試劑盒包含本公開的消化酶組合試劑，即，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合。

88、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是尿嘧啶dna糖基化酶(uracil?dnaglycosylase，udg酶)或單鏈選擇性單功能尿嘧啶dna糖基化酶(single-strand?selective?monofunctional?uracil-dnaglycosylase，smug酶)，所述udg酶或smug酶特異性識別du位點(diǎn)并切除尿嘧啶(uracil，du)從而產(chǎn)生無嘧啶位點(diǎn)。

89、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶是烷基腺嘌呤dna糖基化酶(alkyladenine?dna?glycosylase，aag酶)或者內(nèi)切酶ⅴ(endonuclease?v)，所述aag酶或者內(nèi)切酶ⅴ特異性識別di位點(diǎn)并切除次黃嘌呤(hypoxanthine，di)從而產(chǎn)生無嘌呤位點(diǎn)。

90、在一些實(shí)施方案中，當(dāng)所述非目標(biāo)核酸模板中含有du和di時(shí)，所述消化酶組合中的dna糖基化酶可以是分別識別du和di位點(diǎn)的兩種酶，包括但不限于前述列舉的dna糖基化酶的任意組合，例如udg酶和aag酶。

91、在一些實(shí)施方案中，所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶可以識別ap位點(diǎn)并切斷磷酸二酯鍵，形成缺刻或1個(gè)堿基的缺口。所述ap位點(diǎn)內(nèi)切酶是例如ape1(人源脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶，apurinic-apyrimidinicendonuclease?1)，內(nèi)切酶iii(endonuclease?iii)，內(nèi)切酶iv(endonuclease?iv)，fpg(甲酰胺嘧啶[fapy]-dna糖基化酶，formamidopyrimidine[fapy]-dna?glycosylase)，內(nèi)切酶v(endonuclease?v)，內(nèi)切酶viii(endonuclease?viii)，ogg1(8-氧代鳥嘌呤dna糖基化酶1，8-oxo?guanine?dna?glycosylase?1)，t4?pdg(t4嘧啶二聚體糖基化酶，t4?pyrimidine?dna?glycosylase)，hneil1(human?endonuclease?viii-like1)，hnthl1(human?nth?like?dnaglycosylase?1)中的至少一種。

92、在一些實(shí)施方案中，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶可以對缺刻位點(diǎn)的dna進(jìn)行切割形成雙鏈dna斷裂(double-strandedbreaks，dsb)，所述缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶是例如t7內(nèi)切酶i(t7?endonuclease?i)和錯(cuò)配內(nèi)切酶i(mismatch?endonuclease?i)中的至少一種。

93、在一些實(shí)施方案中，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是特異性作用于dna的5′→3′核酸外切酶，能選擇性地沿5′→3′方向消化5’端磷酸化的雙鏈dna；優(yōu)選地，所述5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶是例如λ核酸外切酶(lambda?exonuclease)。

94、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iv和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、ape1酶和錯(cuò)配內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、ape1酶和t7內(nèi)切酶i；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i。

95、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是udg酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶iii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是smug酶、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、fpg酶和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶；在一些實(shí)施方案中，所述消化酶組合是內(nèi)切酶v、內(nèi)切酶viii和λ核酸外切酶。

96、在一些實(shí)施方案中，本公開中的dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶分別指，含有dna糖基化酶活性、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶活性和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶活性的消化酶。當(dāng)某種消化酶含有兩種以上前述活性時(shí)，所述消化酶組合可以是一種、兩種或三種酶，例如內(nèi)切酶v既含有識別di并將其切割成無嘌呤位點(diǎn)的活性，又能夠識別無嘌呤位點(diǎn)并切割形成一個(gè)缺刻位點(diǎn)，例如所述消化酶組合可以是內(nèi)切酶v和t7內(nèi)切酶i。

97、在一些實(shí)施方案中，本公開中的dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶分別指，含有dna糖基化酶活性、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶活性和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶活性的消化酶。當(dāng)某種消化酶含有兩種以上前述活性時(shí)，所述消化酶組合可以是一種、兩種或三種酶，例如內(nèi)切酶v既含有識別di并將其切割成無嘌呤位點(diǎn)的活性，又能夠識別無嘌呤位點(diǎn)并切割形成一個(gè)缺刻位點(diǎn)，例如所述消化酶組合可以是內(nèi)切酶v和λ核酸外切酶。

98、在一些實(shí)施方案中，所述消化酶的組合可以是任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合，或，任意dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合，包括但不限于前述部分列舉的消化酶組合。

99、在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的消化酶組合試劑是單一組合物，即本公開的消化酶組合在單一組合物中提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的消化酶組合試劑的多個(gè)組合物，即本公開的消化酶組合在分開的組合物中提供。

100、在一個(gè)實(shí)施方案中，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和缺刻位點(diǎn)識別的內(nèi)切酶的組合以0.5-1.5u:3-7u:0.5-10u，例如0.75-1.25u:4-6u:0.7-5u，例如0.9-1.1u:4.5-5.5u:0.6-2u，例如1u:5u:0.8-1u的比例提供。

101、在一個(gè)實(shí)施方案中，dna糖基化酶、ap位點(diǎn)內(nèi)切酶和5'磷酸基團(tuán)依賴的5'-3'核酸外切酶的組合以0.5-1.5u:1.5-3.5u:3-7u，例如0.75-1.25u:2-3u:4-6u，例如1u:2.5u:5u的比例提供。

102、在一些實(shí)施方案中，本公開的消化酶組合試劑中一種或多種酶的量相對于其余酶是過量的。在一些實(shí)施方案中，消化酶組合試劑中的每一種酶的過量獨(dú)立是其上述推薦量的至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多倍。

103、在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的試劑盒包含dntp試劑，所述dntp試劑包含datp、dgtp、dctp和dttp，且包含dutp和ditp中的至少一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，dutp/dttp＝1/n或ditp/dgtp＝1/n，所述n是大于零的常數(shù)，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20；優(yōu)選地，所述n是大于等于1的常數(shù)；更優(yōu)選地，所述n是大于等于3的常數(shù)；最優(yōu)選地，所述n是大于等于5的常數(shù)。任選地，n小于1000或999、500或499、100或99、50或49、25或24、10或9、5或4。

104、在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的試劑盒包含用于實(shí)施本公開第一方面和第二方面所述方法需要的其它試劑，例如dna聚合酶，引物，緩沖物質(zhì)、金屬鹽中的一種或多種。

105、本公開提供上述消化酶組合試劑和/或dntp試劑，及其用于實(shí)施本公開第一方面和第二方面所述方法和/或制備本公開第七方面所述試劑盒的用途。