本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體及在制備asfv-p54納米顆粒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、非洲豬瘟(african?swine?fever,asf)是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fevervirus,asfv)感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要癥狀表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺、淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血，病死率高達(dá)100％，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。世界動物衛(wèi)生組織(world?organization?for?animal?health,oie)將其列為法定報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

2、馬克斯克魯維酵母(kluyveromyces?marxianus，km)是一種非常規(guī)酵母，與釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)同屬于saccharomycetaceae科，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(f?ood?and?drug?administration，fda)的gras認(rèn)證(generally?recognized?as?safe，食品添加劑安全評價)和歐盟食品安全局(european?food?safety?authority，簡稱efsa)的qps認(rèn)證(qualified?presumption?of?safety，安全資格認(rèn)證)的安全酵母，也被中國衛(wèi)計委批準(zhǔn)為新食品原料。

3、申請人于2013年在湖北黃陂自然養(yǎng)殖土豬場成功分離出一株km-c2株(授權(quán)專利號：zl?103952324a)，并于2014年3月3日送往中國湖北省武漢市武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行保藏(cctcc?no：m2014059)。該菌株對黃曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮、赭曲毒素a的生物降解率達(dá)80％以上，同時可用于動物口服解毒。因此，該菌株非常適合作為出發(fā)菌株，并作為攜帶asfv抗原的口服載體應(yīng)用于飼料添加劑中。

4、目前該菌株尚無可用于食用安全級別酵母表達(dá)系統(tǒng)的營養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記及可以對該菌株進(jìn)行遺傳改造的敲除載體。也沒有適用于該菌株的表達(dá)載體。鑒于此，本發(fā)明為該菌株建立適合的遺傳操作體系，實現(xiàn)在酵母基因組上的遺傳操作。為該菌株匹配不同的啟動子-終止子組合及復(fù)制子組合，提供新型候選表達(dá)元件。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供了一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。

2、本發(fā)明的另一個目的在于提供了雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用，該應(yīng)用特別適用于非洲豬瘟亞單位疫苗的制備。

3、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

4、申請人通過篩選，組裝，制備了雙復(fù)制子表達(dá)載體，該載體在馬克斯克魯維酵母中實現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率和高表達(dá)效率的效果，具體如下：

5、一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。

6、含有目的基因的雙復(fù)制子表達(dá)載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

7、一種重組營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母，是將上述雙復(fù)制子表達(dá)載體導(dǎo)入營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中獲得，所述的營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將km-ko-ura3(seqi?d?no.1所示)導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母重獲得；

8、雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用；

9、雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32或重組營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用；

10、以上所述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，是制備非洲豬瘟亞單位疫苗。

11、以上所述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，制備的為納米顆粒形式的asfv-p54蛋白口服疫苗，具體是將cap-linker-p54序列(seq?id?no.3所示)與雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32同源重組后，導(dǎo)入營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中表達(dá)獲得。

12、以上所述的馬克斯克魯維酵母的保藏號為cctcc?no：m2014059。

13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

14、雙復(fù)制系統(tǒng)已成功用于質(zhì)粒的構(gòu)建，然而目前已有的雙復(fù)制子系統(tǒng)僅在穿梭質(zhì)粒中成功應(yīng)用，即兩種復(fù)制子分別屬于不同宿主。其目的在于可以允許質(zhì)粒在不同表達(dá)宿主中實現(xiàn)自我復(fù)制。如大腸桿菌和酵母、大腸桿菌和哺乳動物細(xì)胞等，一般在大腸桿菌中實現(xiàn)擴繁，繼而轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主中實現(xiàn)外源基因的表達(dá)。這種由雙復(fù)制子系統(tǒng)構(gòu)建的穿梭載體在不同宿主中僅有一個復(fù)制子發(fā)揮功能，因此兩種復(fù)制子一般不存在相互作用，也無法在同一宿主中將兩種復(fù)制子的復(fù)制特性所結(jié)合。

15、在本發(fā)明中，申請人創(chuàng)造性的將幾種優(yōu)選復(fù)制子進(jìn)行串聯(lián)，出現(xiàn)可以結(jié)合兩種復(fù)制子優(yōu)良表型的雙復(fù)制子系統(tǒng)。進(jìn)一步的，申請人利用本發(fā)明提供馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)納米顆粒形式的asfv-p54蛋白，為asfv口服免疫策略的研發(fā)提供新思路。

技術(shù)特征：

1.?一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。

2.含有目的基因的權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體。

3.?一種重組營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母，所述的重組營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體導(dǎo)入營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中獲得，所述的營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將seq?id?no.1所示敲除載體導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母重獲得。

4.權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。

5.權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32或權(quán)利要求3所述的重組營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述的亞單位疫苗為非洲豬瘟亞單位疫苗。

7.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的非洲豬瘟亞單位疫苗為納米顆粒形式的asfv-p54蛋白口服疫苗，具體是將seq?id?no.3所示的cap-linker-p54序列與權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32同源重組后，導(dǎo)入營養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中表達(dá)獲得。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體及在制備ASFV?P54納米顆粒中的應(yīng)用。申請人通過篩選，組裝，制備了雙復(fù)制子表達(dá)載體，該載體在馬克斯克魯維酵母中實現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率和高表達(dá)效率的效果，所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pGKD32為SEQ?ID?NO.2所示。申請人利用本發(fā)明提供馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)納米顆粒形式的ASFV?P54蛋白，為ASFV口服免疫策略的研發(fā)提供新思路。

技術(shù)研發(fā)人員：金梅林,高朔,左文峰,黎晶晶,尚宵敏,康超,楊麗,孫小美,杭堯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6