本發(fā)明屬于分子生物學(xué)及遺傳育種，具體涉及一種與甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分顯著關(guān)聯(lián)的位點qfac.c9-1的分子標(biāo)記及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前，油菜育種的主要目標(biāo)包括抗性、產(chǎn)量和品質(zhì)。這些性狀都是復(fù)雜的數(shù)量性狀，受眾多基因共同調(diào)控而且易受環(huán)境條件的影響，傳統(tǒng)的育種方法和技術(shù)手段很難實現(xiàn)這些性狀的精準(zhǔn)改良和突破。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速進(jìn)步和基因編輯等新興生物技術(shù)的廣泛運用，使得這些性狀的分子改良成為可能。

2、油菜品質(zhì)性狀主要包括油菜種子含油量與蛋白質(zhì)含量、油中各脂肪酸組分含量、油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷(硫苷)及其組分含量、纖維素與植酸含量等等。油菜種子脂肪酸組分主要包括棕櫚酸(c16:0)、硬脂酸(c18:0)、油酸(c18:1)、亞油酸(c18:2)、亞麻酸(c18:3)、花生烯酸(20:1)及芥酸(22:1)七種。脂肪酸合成系統(tǒng)首先是合成鏈長十八碳及十六碳的飽和脂肪酸后，飽和脂肪酸再經(jīng)去飽和系統(tǒng)產(chǎn)生不飽和脂肪酸，或在脂肪酸延長酶基因(fae?l)的調(diào)控下，經(jīng)超長鏈脂肪酸合成系統(tǒng)合成二十碳烯酸或芥酸。油酸作為一種單不飽和脂肪酸，無論食用還是工業(yè)用價值都較高。作為食用油，提高菜籽油中的油酸含量，可以減少肥胖人群的心血管疾病發(fā)生率，降低血液中低密度脂蛋白膽固醇含量，預(yù)防動脈硬化；高油酸油可以阻止脂質(zhì)氧化，延長油的保質(zhì)期，延長貨架時間；此外，高油酸菜籽油在被加熱時可以保證被加熱到較高溫度時少冒煙，縮短烹飪時間，降低損耗量；高油酸菜籽油能保證菜油熱穩(wěn)定性，同時還能保證食物被煎炸后具有良好的香味(熊秋芳等，2014)。工業(yè)方面，由于石油緊缺帶來的全球能源危機，人們正在尋找一種可代替石油的生物可再生能源，而高油酸菜籽油能有效甲酯化，在生產(chǎn)生物柴油上受到人們的青睞(官梅，2004)。在脫飽和酶的作用下，油酸轉(zhuǎn)化為亞油酸(ω-6族)，亞油酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為亞麻酸。亞油酸作為一種人體必需脂肪酸，能軟化血管，降低膽固醇含量，降低動脈硬化的風(fēng)險，有利于人體消化吸收(吳謀成，2004)。人體內(nèi)亞油酸缺乏會引起膽固醇和某些飽和脂肪酸結(jié)合而沉積在血管壁上，進(jìn)而導(dǎo)致動脈硬化及心腦血管疾病(周銀珠，2011)。亞麻酸有α-亞麻酸和γ-亞麻酸兩種，其中α-亞麻酸為油菜中亞麻酸的主要存在形式，若人體內(nèi)缺乏α-亞麻酸，脂質(zhì)代謝就會發(fā)生紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致人體免疫力下降、疲勞、動脈粥硬化等癥狀的出現(xiàn)(李加興等，2009)。對于嬰幼兒和青少年，α-亞麻酸缺乏會嚴(yán)重影響其智力發(fā)育，因此α-亞麻酸對于維持人體健康必不可少(劉峰，2007)。另外，α-亞麻酸是epa(二十碳五烯酸，俗稱血管清道夫))和dha(二十二碳六烯酸，俗稱腦黃金)的前體物質(zhì)，食物中只要α-亞麻酸供給充足，人體就可用其合成所需的ω-3系列脂肪酸。芥酸屬于長碳鏈脂肪酸，在人體內(nèi)不易被分解與吸收，營養(yǎng)價值較低，芥酸含量過高還還會限制油酸和亞油酸含量的增加(劉后利，2000；傅廷棟，2004)。然而，芥酸作為工業(yè)用途的脂肪酸前景十分廣闊，芥酸及其衍生物已在鑄鋼、潤滑、塑料、油漆、油墨、化妝品和食品等工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。棕櫚酸和硬脂酸屬飽和脂肪酸熔點較高，易在血管壁上凝固，進(jìn)而引發(fā)高血壓和動脈硬化，還會導(dǎo)致血液膽固醇濃度上升(劉麗莉等，2005)。菜籽油中飽和脂肪酸含量越高，其營養(yǎng)價值越低。綜上所述，多種脂肪酸都有各自的不同功能，因此油菜脂肪酸改良應(yīng)該根據(jù)不同的需求和用途設(shè)置相應(yīng)的育種目標(biāo)。目前我國菜籽油仍主要以食用為主，因此油菜種子脂肪酸改良的重點仍是降低芥酸含量提高油酸、亞油酸和亞麻酸含量。

3、利用連鎖和/或關(guān)聯(lián)定位的方法(鮑丙浩等，2021；蔡東芳等，2016；李施蒙，2016；劉列釗，2014；蒙姜宇，2019；楊盛強，2010；葉桑，2019；張潔夫，2008；burn等，2011；chen等，2018；li等，2014；smooker等，2011；wang等，2015；yan等，2011；zhao等，2008)，油菜中已定位到一批控制種子脂肪酸組分含量的數(shù)量性狀基因位點(qtl)。其中兩個主效qtl位于a8和c3染色體上，對應(yīng)fae1的不同拷貝(li等，2014)。然而，這些qtl不足以解釋油菜種質(zhì)資源種脂肪酸組份含量的變異，這表明仍有新的脂肪酸組分含量調(diào)控位點亟待發(fā)掘。

4、本發(fā)明利用油菜核心關(guān)聯(lián)群體和高密度snp基因型數(shù)據(jù)對種子脂肪酸組分進(jìn)行8個環(huán)境下的全基因組關(guān)聯(lián)分析，旨在找到新的穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)位點，并據(jù)此開發(fā)實用的高通量低成本的分子標(biāo)記，用于對油菜種子脂肪酸組成的分子改良。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是在于提供了檢測甘藍(lán)型油菜c09染色體上第3,592,310位堿基的試劑在甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量篩選育種中的應(yīng)用。

2、本發(fā)明另一個目的在于提供了檢測甘藍(lán)型油菜c09染色體上第3,592,310位堿基的引物在甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量篩選育種中的應(yīng)用。

3、本發(fā)明的最后一個目的在于提供了甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量篩選育種的方法。

4、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

5、甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量顯著關(guān)聯(lián)parms標(biāo)記的獲得：

6、(1)提取本團隊構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜核心關(guān)聯(lián)群體331份材料(li等，2020)的總dna，利用油菜60k?snp芯片(clarke等，2016)對每個樣本進(jìn)行基因型分析。

7、(2)利用illumina?beadstudio基因分型軟件(http://www.illumina.com/)計算群體材料在每個位點的標(biāo)記雜合率(heterozygous?rate)、缺失率(missing?rate)、最小等位基因頻率(minor?allele?frequency)。去掉無多態(tài)性、缺失比列高、無純合基因型、等位基因頻率低、雜合基因型頻率高、位置不確定和多拷貝標(biāo)記，最后獲得24508個高質(zhì)量snp標(biāo)記用于后續(xù)分析。

8、(3)將本團隊構(gòu)建的甘藍(lán)型油菜核心關(guān)聯(lián)群體331份材料分別在南昌2014、武漢2012-2016、鄭州2013-2014八個環(huán)境種植(代號為n14,w12,w13,w14,w15,w16,z13,z14)，成熟期每個小區(qū)收獲10株晾干脫粒，用近紅外儀法測定脂肪酸組分含量(qiu等，2006)：包括、花生烯酸(ara)、芥酸(eru)、亞油酸(lol)、亞麻酸(lon)、油酸(ole)、棕櫚酸(pal)、硬脂酸(ste)。

9、(4)結(jié)合核心關(guān)聯(lián)群體的脂肪酸組成性狀表型數(shù)據(jù)、基因型數(shù)據(jù)和群體結(jié)構(gòu)，利用tassel?5.0軟件(bradbury?et?al.,2007)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。最終在油菜darmorv4參考基因組c09染色體上獲得與多種脂肪酸組分顯著關(guān)聯(lián)的位點qfac.c9-1，其峰值snp標(biāo)記bn-scaff_17190_1-p9206位于第3,592,310位堿基處(堿基為a或g)，可以在八個環(huán)境中被重復(fù)檢測到。

10、(5)提取油菜c09染色體第3,592,310位堿基上下游各100bp的序列，按照引物設(shè)計原則獲得parms檢測引物序列：qfac.c9-1f：tgtaaaagacatgtgatgatggttc；qfac.c9-1ra：gaaggtgaccaagttcatgcttttgcatagatcataagccaaacta；qfac.c9-1rg：gaaggtcggagtcaacggattttgcatagatcataagccaaactg。

11、本發(fā)明的保護(hù)范圍包括：

12、檢測甘藍(lán)型油菜c09染色體上第3,592,310位堿基的試劑在甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量篩選育種中的應(yīng)用。。

13、以上所述的試劑，優(yōu)選的，為引物。

14、以上所述的引物，優(yōu)選的為本發(fā)明提供的parms檢測引物。

15、一種甘藍(lán)型油菜種子脂肪酸組分含量篩選育種的方法，包括利用本領(lǐng)域的常規(guī)方案檢測甘藍(lán)型油菜c09染色體上第3,592,310位堿基，所述的常規(guī)方案包括但不限于：測序法、taqman探針法、as-pcr法、分子信標(biāo)法、高分辨率溶解曲線法、caps法、snapshot法、kasp法、parms法、基因芯片法、質(zhì)譜法。

16、判定方式是：

17、若檢測出為aa基因型，表明該品種種子中花生烯酸和芥酸含量相對較低，而亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量相對較高。

18、若檢出為gg基因型，表明該品種種子中花生烯酸和芥酸含量相對較高，而亞油酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸含量相對較低。

19、本發(fā)明中使用的甘藍(lán)型油菜基因組的版本號是darmor-bzh(version?4.1)https://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/。

20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

21、(1)本發(fā)明獲得了與油菜脂肪酸組分顯著關(guān)聯(lián)的位點qfac.c9-1，且可被重復(fù)檢測到，平均可解釋8.6％的表型方差，可有效應(yīng)用于油菜脂肪酸組成的遺傳改良。

22、(2)本發(fā)明獲得油菜脂肪酸組分顯著關(guān)聯(lián)的parms標(biāo)記，其檢測方法簡便而且成本低廉，可對油菜脂肪酸組分的基因組單倍型區(qū)域進(jìn)行高通量篩選，提高選擇效率和準(zhǔn)確性。