本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，具體涉及用于鎘污染土壤修復(fù)的柳樹自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白ssnramp1及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、土壤鎘污染是全球面臨的重大環(huán)境問題，嚴重危害著土壤質(zhì)量和人體健康。植物修復(fù)是利用植物固定、揮發(fā)、過濾和提取等方式去除土壤重金屬的過程，因其成本低、對環(huán)境友好、可實現(xiàn)原位修復(fù)，在土壤重金屬污染修復(fù)中得到了廣泛應(yīng)用。柳樹生長迅速、適應(yīng)性強、生物量大，同時具有很高的鎘吸收能力，有研究表明，柳樹能夠有效移除土壤中30-50％的鎘，目前已廣泛應(yīng)用在國內(nèi)外鎘污染土壤修復(fù)工程中。遺傳轉(zhuǎn)化是一種高效靶向性的植物育種手段，通過基因工程手段增強柳樹鎘吸收能力具有巨大潛力。迄今為止，負責(zé)柳樹鎘吸收過程中關(guān)鍵基因及其功能尚不明確，這成為進一步提高柳樹修復(fù)效率亟需突破的瓶頸。因此挖掘并解析負責(zé)柳樹鎘吸收關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能，既能明確柳樹吸收鎘的分子機制，又為利用基因工程提高柳樹修復(fù)能力提供重要的基因資源，具有重要的實踐潛力。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供柳樹自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白ssnramp1在鎘污染土壤修復(fù)中的應(yīng)用，為利用基因工程提高植物如柳樹、煙草等對于土壤中鎘污染修復(fù)效率提供重要基因資源。

2、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述用于鎘污染土壤修復(fù)的柳樹自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白基因為ssnramp1，所述ssnramp1基因序列如seq?id?no?1所示。

3、柳樹ssnramp1表達模式分析，以柳樹ssef1α為內(nèi)參基因，引物序列為：

4、ssef1a-f(seq?id?no?2)：tgaagaacggagatgctggt

5、ssef1a-r(seq?id?no?3)：ttggcagcagatttggtcac

6、ssnramp1-f(seq?id?no?4)：gtggcattaacgatgcctgt

7、ssnramp1-r(seq?id?no?5)：tagctgagcaaacagtccca。

8、柳樹ssnramp1酵母異源功能驗證，對ssnramp1基因編碼區(qū)序列進行限制性酶切位點分析，設(shè)計帶酶切位點的pcr擴增引物為：

9、ssnramp1-f(seq?id?no?6)：aagcttatggctgctgaaaaagtt

10、ssnramp1-r(seq?id?no?7)：gaattcctagctctgaacaccatct。

11、ssnramp1亞細胞定位分析，利用dnaman軟件對ssnramp1基因編碼區(qū)進行限制性酶切位點分析，設(shè)計含有hind?iii和ecor?i兩個酶切位點的pcr擴增引物：

12、psat6-egfp-c1

13、gfp-ssnramp1-f(seq?id?no?8)：aagcttccatggctgctgaaaaagtt

14、gfp-ssnramp1-r(seq?id?no?9)：gaattcctagctctgaacaccatc；

15、以含有ssnramp1基因片段的中間表達載體質(zhì)粒為模板，根據(jù)prcs2-2288載體序列設(shè)計同源重組引物：

16、pf(seq?id?no?10)：accacccataatacccataatagctgtttgccaacc

17、pr(seq?id?no?11)：cgatggcaaacagctattatgggtattatgggtgcg。

18、ssnramp1轉(zhuǎn)基因煙草，設(shè)計pcr擴增引物：

19、ssnramp1-f(seq?id?no?12)：

20、cggggatcctctagagtcgacatggctgctgaaaaagtttcttc

21、ssnramp1-r(seq?id?no?13)：

22、gtgatttttgcggacctgcagctagctctgaacaccatctattctgg。

23、通過基因工程手段構(gòu)建表達柳樹ssnramp1的轉(zhuǎn)基因煙草，提高轉(zhuǎn)基因植物富集土壤重金屬鎘的能力。

24、本發(fā)明所述柳樹ssnramp1的載體。

25、進一步地，所述載體為將目的基因片段連接到表達載體pcambia1305。

26、本發(fā)明所述表達柳樹ssnramp1的細胞系或宿主菌。

27、進一步地，所述宿主菌為根癌農(nóng)桿菌。

28、本發(fā)明所述柳樹ssnramp1、所述表達載體、所述載體或者所述宿主菌在提高植物富集土壤重金屬鎘中的應(yīng)用。

29、本發(fā)明所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1、所述表達盒、所述載體或者所述宿主菌在培育具有富集土壤重金屬鎘的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

30、本發(fā)明所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1的轉(zhuǎn)基因煙草在提高轉(zhuǎn)基因植物富集土壤重金屬鎘中的應(yīng)用。

31、進一步地，所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1的轉(zhuǎn)基因煙草在提高轉(zhuǎn)基因植物富集土壤重金屬鎘的能力，包括如下步驟：

32、(1)構(gòu)建所述柳樹ssnramp1的表達載體；

33、(2)將所構(gòu)建的柳樹ssnramp1表達載體轉(zhuǎn)化到植物中；

34、(3)培育篩選并獲得富集土壤重金屬鎘提高的轉(zhuǎn)基因植株。

35、進一步地，所述植物為煙草。

36、通過基因工程手段構(gòu)建表達柳樹ssnramp1的轉(zhuǎn)基因煙草，ssnramp1轉(zhuǎn)基因植株材料包括nramp1-ex1、nramp1-ex2、nramp1-ex3、nramp1-ex4。

37、有益效果：本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢：

38、本發(fā)明中的柳樹ssnramp1具有轉(zhuǎn)運鎘的活性，且ssnramp1是定位在細胞質(zhì)膜上的膜轉(zhuǎn)運蛋白。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和35s強啟動子啟動ssnramp1在煙草中表達后，在鎘暴露環(huán)境下，與野生型相比，表達ssnramp1的煙草生長未受到顯著影響，轉(zhuǎn)基因植株根系鎘濃度增加了64％-128％，地上部鎘濃度增加了35％-51％，說明柳樹ssnramp1在對鎘污染土壤修復(fù)工程具有重要意義。

技術(shù)特征：

1.用于鎘污染土壤修復(fù)的柳樹自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白基因ssnramp1，其特征在于，所述ssnramp1基因cds序列如seq?id?no?1所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于所述柳樹ssnramp1表達模式分析，以柳樹ssef1a為內(nèi)參基因，設(shè)計引物序列為：

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于所述柳樹ssnramp1酵母異源功能驗證，對ssnramp1編碼區(qū)序列進行限制性酶切位點分析，設(shè)計含有hind?iii和ecor?i兩個酶切位點的pcr擴增引物為：

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于所述ssnramp1亞細胞定位分析，對ssnramp1基因編碼區(qū)進行限制性酶切位點分析，設(shè)計含有hind?iii和ecor?i兩個酶切位點的pcr擴增引物為：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，用于創(chuàng)制所述ssnramp1轉(zhuǎn)基因煙草的引物為：

6.一種含權(quán)利要求1所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1的載體。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所述載體為將目的基因片段連接到表達載體pcambia1305。

8.一種權(quán)利要求1所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1或權(quán)利要求6所述載體在提高植物富集土壤重金屬鎘中的應(yīng)用。

9.一種權(quán)利要求1所述柳樹轉(zhuǎn)運蛋白基因ssnramp1或權(quán)利要求6所述載體在培育具有富集土壤重金屬鎘的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述應(yīng)用，其特征在于，所述植物為煙草或柳樹。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開一種柳樹自然抗性相關(guān)巨噬細胞蛋白SsNramp1在鎘污染土壤修復(fù)基因工程中的應(yīng)用。本發(fā)明中的柳樹SsNramp1具有轉(zhuǎn)運鎘的活性，且SsNramp1是定位在細胞質(zhì)膜上的膜轉(zhuǎn)運蛋白。利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)和35S強啟動子啟動SsNramp1在煙草中表達該蛋白后，鎘暴露環(huán)境下，與野生型相比，轉(zhuǎn)SsNramp1基因的煙草生長未受到顯著影響，而根系鎘濃度增加了64％?128％，地上部鎘濃度增加了35％?51％。本發(fā)明說明柳樹SsNramp1在對鎘污染土壤修復(fù)工程具有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：郭楠,高菲,陶俊
受保護的技術(shù)使用者：揚州大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6