本發(fā)明涉及中藥材鑒定，尤其涉及一種用于烏梢蛇及5種混偽品藥材、水提物的多重pcr-ce鑒別的引物組合、方法及其應用。

背景技術：

1、動物藥蛇類在我國中醫(yī)藥與民間醫(yī)藥中具有悠久的歷史，且在長期臨床應用中起著重要作用。根據(jù)《the?reptile?database》的收錄，全世界有蛇3425種，中國有241種，而用于中藥的蛇涉及5科、70種，明朝李時珍在《本草綱目》中記載的藥用蛇類已超過17種。烏梢蛇為游蛇科動物烏梢蛇zaocys?dhumnades(cantor)的干燥體。烏梢蛇多在夏、秋二季捕捉，剖開腹部或先剝皮留頭尾，除去內(nèi)臟，盤成圓盤狀，干燥。其性平，味甘，具有祛風活絡鎮(zhèn)痛，除濕攻毒之功效，臨床用于風濕頑痹、麻木拘攣、中風、口眼歪斜、半身不遂、抽搐、破傷風癥、麻風、瘰疬、惡瘡等。

2、烏梢蛇在《國家重點保護野生藥材物種名錄》中，被列為國家二級保護野生藥材物種，也就說明烏梢蛇是分布區(qū)域縮小、資源處于衰竭狀態(tài)的重要野生藥材物種。2020年9月，國家林草局發(fā)布了《關于規(guī)范禁食野生動物分類管理范圍的通知》，禁止以食用為目的的烏梢蛇養(yǎng)殖活動，僅允許用于藥用、展示、科研等非食用性目的的養(yǎng)殖。2021年烏梢蛇被列入《世界自然保護聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄(iucn)》，目前為無危級別。隨著我國老齡化步伐的加快，有心腦血管疾病、中風偏癱人員增多，而治療中風偏癱祛風搜風首選的中藥是烏梢蛇。在全國制藥企業(yè)中，以烏梢蛇為投料的中成藥不斷問世，如醫(yī)癇丸、筋骨通膠囊、白癜風膠囊等產(chǎn)品應運而生，它們的用量與日同增。

3、近年來，由于資源有限，價格昂貴，市售常見的蛇類藥材均普遍存在著偽品和混淆品現(xiàn)象，這給臨床用藥的安全及藥物的質(zhì)量和療效帶來潛在危險。此外，藥材在加工處理后，難以辨認，這是造成其性狀鑒別困難的原因。dna對于同一物種而言，不會隨著外界因素的改變而改變，其差異主要存在于物種之間，具有遺傳穩(wěn)定性高、化學穩(wěn)定性強等特點。既可拋開形態(tài)相似的表象，又可避免化學特征的過于多變，從基因水平上提供一種鑒別依據(jù)，具有更加準確、可靠的特點，因此近年來分子鑒定正作為理化鑒定的補充，加強了藥材的鑒別，對人類健康與保證藥材的質(zhì)量起到重要作用。目前基于pcr對烏梢蛇進行鑒別的技術主要有特異性pcr、環(huán)介導等溫擴增、實時熒光定量pcr法、dna條形碼等，但這些技術的鑒別主要應用于鑒別烏梢蛇的藥材。烏梢蛇經(jīng)受熱提取等加工手段處理后，其dna結構會發(fā)生斷裂，現(xiàn)有的藥材鑒別方法較難適用，質(zhì)量風險較大，亟需解決烏梢蛇在失去飲片外形特征后的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒定問題，而且現(xiàn)有的方法未涉及黑眉錦蛇偽品的鑒別，另外關于可同時鑒別多物種蛇的摻偽的研究文獻也鮮有報道。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題在于，提供一種用于烏梢蛇及5種混偽品藥材、水提物的多重pcr-ce鑒別的引物組合，可同時有效鑒別烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇和灰鼠蛇。

2、本發(fā)明所要解決的技術問題還在于，提供一種用于鑒別烏梢蛇及5種混偽品藥材、水提物的多重pcr-ce鑒別方法。

3、本發(fā)明所要解決的技術問題還在于，提供一種上述引物組合在鑒別烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇和灰鼠蛇中的應用。

4、為達到上述技術效果，本發(fā)明提供了一種用于烏梢蛇及其混偽品藥材、水提物的多重pcr-ce鑒別的引物組合，包括第一引物對、第二引物對、第三引物對、第四引物對、第五引物對和第六引物對；

5、其中，所述第一引物對的上游引物的序列如seq?id?no:1所示，下游引物的序列如seq?id?no:2所示；

6、所述第二引物對的上游引物的序列如seq?id?no:3所示，下游引物的序列如seqid?no:4所示；

7、所述第三引物對的上游引物的序列如seq?id?no:5所示，下游引物的序列如seqid?no:6所示；

8、所述第四引物對的上游引物的序列如seq?id?no:7所示，下游引物的序列如seqid?no:8所示；

9、所述第五引物對的上游引物的序列如seq?id?no:9所示，下游引物的序列如seqid?no:10所示；

10、所述第六引物對的上游引物的序列如seq?id?no:11所示，下游引物的序列如seqid?no:12所示。

11、相應的，本發(fā)明還公開了上述引物組合的應用，包括下述的至少一種：

12、鑒別烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇和灰鼠蛇；

13、制備用于鑒別烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇和灰鼠蛇的試劑盒；

14、鑒定待測蛇是否為烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇或灰鼠蛇；

15、制備用于鑒定待測蛇是否為烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇或灰鼠蛇的試劑盒；

16、鑒定待測樣品中是否含有烏梢蛇和/或百花錦蛇和/或赤鏈蛇和/或黑眉錦蛇和/或王錦蛇和/或灰鼠蛇；

17、制備用于鑒定待測樣品中是否含有烏梢蛇和/或百花錦蛇和/或赤鏈蛇和/或黑眉錦蛇和/或王錦蛇和/或灰鼠蛇的試劑盒。

18、相應的，本發(fā)明還公開了一種鑒別烏梢蛇及其混偽品藥材、水提物的試劑盒，包括上述的引物組合。

19、相應的，本發(fā)明還公開了一種鑒別烏梢蛇及其混偽品藥材、水提物的多重pcr-ce鑒別方法，包括以下步驟：

20、(1)提取待檢測樣品的dna；

21、(2)以待檢測樣品的dna為模板進行多重pcr擴增；

22、(3)對擴增產(chǎn)物進行電泳檢測，若擴增產(chǎn)物中含有347bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有烏梢蛇藥材和/或烏梢蛇水提物；

23、若擴增產(chǎn)物中含有247bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有百花錦蛇藥材和/或百花錦蛇水提物；

24、若擴增產(chǎn)物中含有206bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有赤鏈蛇藥材和/或赤鏈蛇水提物；

25、若擴增產(chǎn)物中含有144bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有黑眉錦蛇藥材和/或黑眉錦蛇水提物；

26、若擴增產(chǎn)物中含有125bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有王錦蛇藥材和/或王錦蛇水提物；

27、若擴增產(chǎn)物中含有99bp的dna特征峰，則待檢測樣品含有灰鼠蛇藥材和/或灰鼠蛇水提物。

28、作為上述技術方案的改進，步驟(2)中多重pcr擴增程序包括以下步驟：在92℃～96℃預變性4min～8min；在92℃～95℃變性20s～40s，在60℃～70℃退火30s～50s，循環(huán)20次～30次；在70℃～75℃延伸3min～6min。

29、作為上述技術方案的改進，步驟(2)中多重pcr擴增程序包括以下步驟：在95℃預變性5min；在95℃變性30s，在65℃退火45s，循環(huán)25次；在72℃延伸5min。

30、作為上述技術方案的改進，步驟(2)中多重pcr擴增的pcr擴增體系包括以下物質(zhì)：dna聚合酶2μl～8μl，第一引物對0.3μl～0.6μl，第二引物對0.3μl～0.6μl，第三引物對0.3μl～0.6μl，第四引物對0.3μl～0.6μl，第五引物對0.3μl～0.6μl，第六引物對0.3μl～0.6μl，模板dna?0.5μl～1.5μl，補充滅菌蒸餾水至終體積25μl。

31、作為上述技術方案的改進，步驟(2)中多重pcr擴增的pcr擴增體系包括以下物質(zhì)：dna聚合酶5μl，第一引物對0.5μl，第二引物對0.5μl，第三引物對0.5μl，第四引物對0.3μl，第五引物對0.6μl，第六引物對0.6μl，模板dna?1μl，補充滅菌蒸餾水至終體積25μl。

32、作為上述技術方案的改進，所述模板dna的濃度為50ng/μl～300ng/μl。

33、作為上述技術方案的改進，步驟(1)所述待檢測樣品為烏梢蛇及其混偽品藥材或水提物；

34、待檢測烏梢蛇及其混偽品藥材的dna的提取包括以下步驟：將待檢測烏梢蛇及其混偽品藥材充分研磨后，取30mg～80mg研磨后的樣品采用dna試劑盒提取dna，檢測樣本dna的純度和濃度后冷凍保存；

35、待檢測烏梢蛇及其混偽品水提物的dna的提取包括以下步驟：取待檢測烏梢蛇及其混偽品水提物的凍干粉末30mg～80mg，使用兩步ctab法提取dna，檢測樣本dna的純度和濃度后冷凍保存。

36、作為上述技術方案的改進，步驟(3)所述電泳檢測為瓊脂糖凝膠電泳檢測，包括以下步驟：將pcr擴增產(chǎn)物與緩沖液混合，取6μl～8μl點樣于瓊脂糖凝膠上，于120v～140v電壓的條件下電泳25min～45min，經(jīng)gelred顯色，得到凝膠成像結果。

37、作為上述技術方案的改進，步驟(3)所述電泳檢測為毛細管電泳檢測，包括以下步驟：將pcr擴增產(chǎn)物通過分析儀進行毛細管電泳檢測，并根據(jù)目標條帶大小進行譜圖校正，峰值檢測閾值強度為100～30000，導出數(shù)據(jù)。

38、實施本發(fā)明實施例，具有如下有益效果：

39、1、本發(fā)明進行了烏梢蛇、百花錦蛇、赤鏈蛇、黑眉錦蛇、王錦蛇和灰鼠蛇的多重pcr鑒別引物設計，并建立了烏梢蛇及其五種常見混偽品藥材、水提物的鑒別方法，解決了蛇類水提物在失去形態(tài)后難以鑒別及水提物受熱提取后dna結構發(fā)生斷裂的問題，通過同一個擴增條件即可鑒別六個不同物種蛇，鑒別效率高，成本低，鑒別準確性好。

40、2、本發(fā)明將毛細管電泳與多重pcr技術相結合，提高了檢測的靈敏度，多重體系中原料檢出限為2.344ng，水提物檢出限為18.75ng，此外該鑒別體系可檢出在烏梢蛇藥材中摻有1％的混偽品和在烏梢蛇水提物中摻有1％的混偽品。