本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及一種改變dna聚合酶ζ活性的方法。

背景技術(shù)：

1、低保真性跨損傷dna合成是dna突變的重要來(lái)源。dna聚合酶ζ是真核細(xì)胞中參與低保真性跨損傷dna合成(translesion?dna?synthesis,tls)的主要聚合酶，其催化亞基rev3l因缺少3’至5’外切酶活性而喪失校正功能。在酵母細(xì)胞中，聚合酶ζ并不影響細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖，但酵母細(xì)胞絕大部分(>90％)因dna損傷所致突變，和一半以上自發(fā)突變的形成依賴于聚合酶ζdna合成活性。在高等真核細(xì)胞中，聚合酶ζ不僅參與dna突變形成，同時(shí)也在細(xì)胞增殖及胚胎發(fā)育中發(fā)揮了必不可少的生物學(xué)功能。

2、人dna聚合酶ζ催化亞基rev3l蛋白成熟過(guò)程中存在一種序列依賴的蛋白切割事件，一種高度保守的蘇氨酸天冬氨酸酶tasp1能特異地催化rev3l蛋白525位天門冬氨酸和526位甘氨酸殘基間肽鍵的水解，產(chǎn)生約70kda大小的氨基端片段(rev3l-n70)和大于310kda、包含了完整聚合酶結(jié)構(gòu)域的碳端片段(rev3l-c)。人細(xì)胞中逾90％的rev3l蛋白都是以切割產(chǎn)物的形式存在于緊密互作的切割后復(fù)合物中。

3、在癌癥治療中，腫瘤細(xì)胞高速增殖的特性使其生長(zhǎng)和增殖極大程度地依賴于復(fù)制壓力緩解機(jī)制；而另一方面，通過(guò)誘導(dǎo)復(fù)制壓力產(chǎn)生細(xì)胞毒性是目前腫瘤化療的主要策略之一?？鐡p傷dna合成是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中dna損傷耐受的主要途徑，幫助緩解復(fù)制壓力。因此，dna聚合酶ζ活性非常有可能成為改善腫瘤細(xì)胞藥物敏感度及化療耐藥性的重要靶點(diǎn)。然而，在哺乳動(dòng)物中，rev3l蛋白對(duì)于正常細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和個(gè)體發(fā)育都不可或缺。rev3l表達(dá)下調(diào)又可顯著增加細(xì)胞內(nèi)dna損傷的累積和染色體不穩(wěn)定性，并與多種癌癥易感性正相關(guān)。因此，簡(jiǎn)單地缺失rev3l表達(dá)在改善細(xì)胞對(duì)藥物敏感度的同時(shí)會(huì)極大地增加細(xì)胞惡化的可能性，且對(duì)正常細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖也存在嚴(yán)重干擾，這些都限制了將dna聚合酶ζ作為改善腫瘤細(xì)胞藥物敏感度和耐藥性靶點(diǎn)的應(yīng)用。

4、與此同時(shí)，dna突變?cè)谔囟ㄉ飳W(xué)過(guò)程中具有積極意義。例如，免疫球蛋白基因可變區(qū)體細(xì)胞超突變(somatic?hypermutation,shm)直接決定了免疫球蛋白抗原識(shí)別多樣性。在體外實(shí)現(xiàn)高效誘導(dǎo)免疫球蛋白基因可變區(qū)發(fā)生體細(xì)胞超突變是建立全流程體外抗體誘導(dǎo)和篩選系統(tǒng)的基礎(chǔ)。雖然有工作顯示，dna聚合酶ζ缺少可顯著抑制小鼠體內(nèi)shm的發(fā)生，但簡(jiǎn)單過(guò)表達(dá)rev3l并不能有效提升dna聚合酶ζ活性，這些限制了將dna聚合酶ζ作為靶點(diǎn)構(gòu)建高效誘導(dǎo)免疫球蛋白基因發(fā)生shm的細(xì)胞系統(tǒng)的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種改變dna聚合酶ζ活性的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法有效改變dna聚合酶ζ活性的問(wèn)題。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下：提供一種改變dna聚合酶ζ活性的方法，包括：通過(guò)改變?nèi)藃ev3l-n70蛋白s279，s282和s286位殘基磷酸化/去磷酸化修飾，或改變r(jià)ev3l-n70穩(wěn)定性，或改變r(jià)ev3l-n70與rev3l-c蛋白互作，或改變caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割事件來(lái)改變dna聚合酶ζ活性，即實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)或削弱dna聚合酶ζ活性。

3、本發(fā)明的有益效果為：

4、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)：

5、進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)人rev3l-n70蛋白s279，s282和s286位殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變?cè)鰪?qiáng)或減弱s279，s282和s286位殘基的磷酸化/去磷酸化修飾，改變dna聚合酶ζ活性。

6、進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)人rev3l-n70蛋白s279，s282和s286位點(diǎn)發(fā)生丙氨酸替換突變抑制其磷酸化修飾來(lái)減弱dna聚合酶ζ活性；或通過(guò)對(duì)人rev3l-n70蛋白s279，s282和s286位點(diǎn)發(fā)生天冬氨酸/谷氨酸替換突變模擬該位點(diǎn)發(fā)生持續(xù)磷酸化修飾來(lái)增強(qiáng)dna聚合酶ζ活性。

7、進(jìn)一步，通過(guò)對(duì)細(xì)胞施加復(fù)制壓力來(lái)改變dna聚合物ζ活性。

8、當(dāng)細(xì)胞面臨復(fù)制壓力時(shí)，rev3l-n70蛋白s279，s282和s286位殘基能發(fā)生atr介導(dǎo)的磷酸化修飾，可提高細(xì)胞內(nèi)dna聚合物ζ活性，而抑制其磷酸化修飾則減弱dna聚合物ζ活性。當(dāng)細(xì)胞面臨復(fù)制壓力時(shí)，可誘導(dǎo)rev3l-n70蛋白s279簇絲氨酸磷酸化，可削弱rev3l-n70與rev3l-c的互作，進(jìn)而改變dna聚合物ζ活性。復(fù)制壓力可為紫外照射、羥基脲(hu)處理、順鉑(ddp)處理等化學(xué)和物理方式。

9、上述影響rev3l活化的磷酸化修飾所在s279絲氨酸簇的序列為tsqmsqpesqd，該位點(diǎn)發(fā)生丙氨酸替換突變會(huì)抑制其磷酸化，而該位點(diǎn)發(fā)生天冬氨酸/谷氨酸替換突變可模擬持續(xù)磷酸化。

10、進(jìn)一步，在施加復(fù)制壓力下或誘導(dǎo)atr激酶活化的條件下，通過(guò)促進(jìn)或抑制atr表達(dá)或活性改變dna聚合酶ζ活性。

11、在施加復(fù)制壓力或誘導(dǎo)atr激酶活化的條件下，利用sirna或shrna或atr特異小分子抑制劑抑制atr的表達(dá)或活性，實(shí)現(xiàn)對(duì)rev3l蛋白s279簇絲氨酸磷酸化修飾的干擾，進(jìn)而抑制相應(yīng)處理?xiàng)l件下dna聚合酶ζ的活化，干擾dna聚合酶ζ在跨損傷dna合成中的生物學(xué)功能，提升細(xì)胞對(duì)化療藥物引起的復(fù)制壓力的敏感性，降低dna聚合酶ζ介導(dǎo)的dna突變所導(dǎo)致的耐藥性。

12、或者直接利用atr激活劑或atr激活蛋白截短片段激活atr，促進(jìn)atr介導(dǎo)的rev3l磷酸化，進(jìn)而改變dna聚合酶ζ活性。

13、進(jìn)一步，在施加復(fù)制壓力下，通過(guò)促進(jìn)或抑制chk1和pp2a表達(dá)/活性改變dna聚合酶ζ活性。

14、當(dāng)細(xì)胞面臨復(fù)制壓力時(shí)，rev3l-n70蛋白上s279，s282和s286位殘基能發(fā)生atr介導(dǎo)的磷酸化修飾。chk1-pp2a通路可以抑制rev3l-n70蛋白上s279，s282和s286位殘基去磷酸化反應(yīng)，提升rev3l-n70蛋白s279簇絲氨酸穩(wěn)定態(tài)磷酸化修飾水平，能夠增加細(xì)胞內(nèi)dna聚合酶ζ活性。具體為：利用sirna或shrna或chk1小分子抑制劑抑制chk1的表達(dá)或活性，通過(guò)抑制chk1介導(dǎo)的pp2a磷酸化修飾，抑制pp2a活化，干擾pp2a介導(dǎo)的s279簇絲氨酸去磷酸化反應(yīng)，提升該位點(diǎn)的磷酸化修飾程度，促進(jìn)dna聚合酶ζ的活化。利用sirna或shrna或pp2a小分子抑制劑抑制pp2a的表達(dá)或活性，干擾pp2a介導(dǎo)的s279簇絲氨酸去磷酸化反應(yīng)，提升該位點(diǎn)的磷酸化修飾程度，促進(jìn)dna聚合酶ζ的活性。

15、進(jìn)一步，通過(guò)封閉或促進(jìn)rev3l-n70蛋白上s279，s282和s286位殘基發(fā)生磷酸化/去磷酸化修飾來(lái)促進(jìn)或封閉rev3l-n70和rev3l-c蛋白互作，改變dna聚合酶ζ的活性；或通過(guò)與rev3l-n70產(chǎn)生干擾競(jìng)爭(zhēng)來(lái)影響rev3l-n70和rev3l-c蛋白互作，改變dna聚合酶ζ的活性。

16、rev3l為dna聚合酶ζ的催化亞基，rev3l蛋白成熟過(guò)程中存在tasp1介導(dǎo)的水解事件，產(chǎn)生rev3l-n70和rev3l-c兩個(gè)片段，其中rev3l-n70為rev3l蛋白的氨基端切割片段，rev3l-c為rev3l蛋白的羧基端切割片段。rev3l蛋白共包括3130個(gè)氨基酸，其中rev3l-n70包括525個(gè)氨基酸，rev3l-c包括2605個(gè)氨基酸。rev3l-c包含了保守的dna聚合酶催化中心，在dna合成時(shí)進(jìn)行鏈延伸的功能。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)rev3l-n70能負(fù)調(diào)控rev3l-c上的聚合酶催化中心，這一機(jī)制能確保在細(xì)胞正常生長(zhǎng)過(guò)程中，rev3l介導(dǎo)的低保真度dna合成受到嚴(yán)格管控。發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)rev3l-n70蛋白s279簇絲氨酸磷酸化修飾可以削弱rev3l-n70與rev3l-c的互作，進(jìn)而解除rev3l-n70對(duì)rev3l-c上聚合酶催化活性中心的抑制，激活dna聚合酶ζ。因此可以通過(guò)小肽或小分子化合物來(lái)封閉rev3l-n70與rev3l-c的互作，進(jìn)而促進(jìn)dna聚合酶ζ的活化。該小肽或小分子的作用靶點(diǎn)是影響rev3l-n70蛋白s279，s282和s286位殘基的磷酸化/去磷酸化修飾，進(jìn)而影響rev3l-n70和rev3l-c蛋白互作，最終影響dna聚合酶ζ的活性和蛋白穩(wěn)定性。

17、除了上述改變r(jià)ev3l-n70蛋白s279簇絲氨酸磷酸化修飾來(lái)削弱rev3l-n70與rev3l-c的互作方式外，還可以利用靶向rev3l-n70或rev3l-c蛋白上兩者互作界面的小分子多肽、小分子化合物、抗體等，去競(jìng)爭(zhēng)或干擾rev3l-n70與rev3l-c的蛋白互作，進(jìn)而影響dna聚合酶ξ的活性。

18、進(jìn)一步，通過(guò)促進(jìn)或抑制caspase的表達(dá)或活性來(lái)改變dna聚合酶ζ活性；或抑制rev3l-c上切割位點(diǎn)的的定點(diǎn)突變來(lái)改變dna聚合酶ζ活性；或者封閉rev3l蛋白上caspase作用的序列元件來(lái)改變dna聚合酶ζ活性；其中，caspase作用的序列元件的氨基酸序列為sqidg。

19、rev3l-n70在抑制dna聚合酶ζ催化活性的同時(shí)也維護(hù)了rev3l-c蛋白穩(wěn)定性，在復(fù)制壓力下，被釋放的rev3l-c會(huì)發(fā)生caspase介導(dǎo)的蛋白切割和蛋白酶介導(dǎo)的降解，進(jìn)而有效地限制了活化后的易錯(cuò)型dna聚合酶ζ的作用時(shí)間，控制了dna聚合酶ζ介導(dǎo)的低保真度dna合成可能對(duì)基因組穩(wěn)定性造成的不利影響。

20、caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割事件可以影響dna聚合酶ζ活性，因此可以通過(guò)改變caspase的表達(dá)或活性，如通過(guò)加入caspase?3和7小分子抑制劑抑制caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割和降解，改變dna聚合酶ζ活性；或者使rev3l-c的切割位點(diǎn)發(fā)生定點(diǎn)突變來(lái)改變dna聚合酶ζ活性，如rev3l-c蛋白d2268位殘基發(fā)生丙氨酸替換突變抑制caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割來(lái)改變dna聚合酶ζ活性。還可以通過(guò)小肽或小分子化合物促進(jìn)或封閉caspase作用的序列元件，該序列元件為rev3l-c上與caspase作用的部分，封閉了該部分，就能干擾活化后發(fā)生caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割，影響dna聚合酶ζ活性。

21、本發(fā)明具有以下有益效果：

22、本發(fā)明提供了一種改變dna聚合酶ζ活性的方法，在不直接干擾rev3l蛋白表達(dá)水平的前提下，通過(guò)改變?nèi)藃ev3l蛋白s279簇絲氨酸的磷酸化修飾，或rev3l-n70穩(wěn)定性，或rev3l-n70與rev3l-c蛋白互作，或caspase介導(dǎo)的rev3l-c切割事件來(lái)改變dna聚合酶ζ活性即實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)或削弱dna聚合酶ζ活性。

23、通過(guò)過(guò)表達(dá)rev3l并不能有效提升dna聚合酶ζ活性，而敲除rev3l后也會(huì)存在問(wèn)題如會(huì)影響正常細(xì)胞生長(zhǎng)，本發(fā)明從穩(wěn)定或解除rev3l活性自抑制機(jī)制的角度，提供了抑制或增強(qiáng)dna聚合酶ζ活性的有效方法。