本發(fā)明屬于植物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種創(chuàng)制超高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)c4作物的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、碳四植物常寫作c4植物。生長過程中從空氣中吸收二氧化碳首先合成蘋果酸或天門冬氨酸等含四個碳原子化合物的植物，如玉米、甘蔗等。而小麥、水稻等作物先合成磷甘油酸等三碳原子分子，為c3植物。c4植物較之c3植物具有生長能力強、二氧化碳利用率高、需水分量少等許多優(yōu)點。

2、禾本科經(jīng)濟植物中約有300種屬c4植物。培育近似c4植物的新品種，對全世界糧食狀況的改善具有重大意義。

3、c4植物玉米(zea?mays?l.)是全球范圍內(nèi)廣泛種植的首要經(jīng)濟作物和糧食作物。栽培玉米的種子可作為人類的糧食和畜禽飼料或加工成淀粉、釀酒等工業(yè)原料，胚芽部分也可用來煉油，制造人工植物油，莖葉可作為家畜的青貯飼料或干飼料。隨著人口增長，進(jìn)行玉米性狀改良、品質(zhì)提高是當(dāng)前玉米育種的重要目標(biāo)。然而，玉米的性狀改良、品質(zhì)提高或產(chǎn)量提高仍然有限，人們對玉米的認(rèn)識仍然不足。

4、在生產(chǎn)上，往往單個基因的應(yīng)用由于材料背景和環(huán)境的影響貢獻(xiàn)的改良效應(yīng)非常有限，通常需要多個基因的有效聚合來改良一個或多個目標(biāo)性狀，這就是基因聚合育種(gene?pyramiding?breeding)。

5、然而，并不是所有優(yōu)良的基因聚合都可以產(chǎn)生理想的疊加效應(yīng)或表型，多會發(fā)生無效應(yīng)、甚至產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)。例如，將nadh-gogat與nad-idh或nadh-gdh聚合并沒有提高植株的表型和氮素利用，說明植物體內(nèi)的c/n平衡無法進(jìn)一步通過此策略改良(canas?et?al.,2020)，也說明不同基因的聚合過程相對復(fù)雜。

6、因此，研究如何進(jìn)一步提高或改良玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)等優(yōu)良性狀，對于大幅提高玉米產(chǎn)量具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種創(chuàng)制超高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)c4作物的分子育種技術(shù)及其應(yīng)用。

2、在本發(fā)明的第一方面，提供一種改良c4作物籽?；蚯o稈性狀或制備籽?；蚯o稈性狀改良的c4作物的方法，包括：在c4作物中聯(lián)合上調(diào)gif1和pho1；2的表達(dá)或活性；所述性狀改良包括：(i)維持莖稈綠色、增加青貯用莖稈的生物量；(ii)增加莖稈糖含量、降低莖稈磷含量；(iii)降低籽粒磷含量；(iv)降低籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量。

3、在本發(fā)明的另一方面，提供一種提高c4作物產(chǎn)量或生物量性狀的方法，包括：在c4作物中聯(lián)合上調(diào)gif1和pho1；2的表達(dá)或活性；所述提高產(chǎn)量或生物量性狀包括：(a)大幅提高(50％或以上)產(chǎn)量；(b)提高生物量；(c)提高磷利用率；(d)提高光合效率。

4、在一種或多種實施方式中，所述提高產(chǎn)量(包括單株產(chǎn)量)或生物量(包括單株生物量)包括：增加株高，增大根系，增加每穗產(chǎn)量，增加每穗籽粒數(shù)，增加籽粒百粒重，增加莖稈直徑，增大葉片，增加穗長；較佳地，所述增加每穗籽粒數(shù)包括：增加籽粒行數(shù)，增加每行籽粒數(shù)。

5、在一種或多種實施方式中，所述的上調(diào)gif1和pho1；2的表達(dá)或活性包括：在c4作物中過表達(dá)gif1和pho1；2；較佳地，包括：將gif1和pho1；2基因或含有所述基因的表達(dá)盒(如包含于表達(dá)構(gòu)建物或表達(dá)載體中)引入c4作物中；將提高c4作物中g(shù)if1和pho1；2基因表達(dá)或活性的基因編輯試劑引入c4作物中；以表達(dá)增強型啟動子或組織特異性啟動子提高c4作物中g(shù)if1和pho1；2基因表達(dá)，或提高其在特定組織中的表達(dá)；以增強子提高c4作物中g(shù)if1和pho1；2基因表達(dá)；或，在不同c4作物中定向篩選具有g(shù)if1和pho1；2基因高表達(dá)的品種，通過雜交育種的方式獲得性狀改良的后代。

6、在本發(fā)明的另一方面，提供一種gif1和pho1；2的組合或它們的上調(diào)分子的用途，用于改良c4作物的性狀，或制備性狀改良的c4作物；其中，所述改良性狀包括：(i)維持莖稈綠色、增加青貯用莖稈的生物量；(ii)增加莖稈糖含量、降低莖稈磷含量；(iii)降低籽粒磷含量；(iv)降低籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量。

7、在本發(fā)明的另一方面，提供一種gif1和pho1；2的組合或它們的上調(diào)分子的用途，用于提高c4作物產(chǎn)量或生物量性狀；其中，所述提高產(chǎn)量或生物量性狀包括：(a)提高產(chǎn)量；(b)提高生物量；(c)提高磷利用率；(d)提高光合效率。

8、在一種或多種實施方式中，所述的上調(diào)分子包括：表達(dá)gif1和pho1；2的表達(dá)盒(如包含于表達(dá)構(gòu)建物或表達(dá)載體中)；提高c4作物中g(shù)if1和pho1；2基因表達(dá)或活性的基因編輯試劑；或與gif1和pho1；2相互作用、從而提高其表達(dá)或活性的上調(diào)分子。

9、在本發(fā)明的另一方面，提供一種c4作物細(xì)胞，其表達(dá)外源的gif1和pho1；2的表達(dá)盒；較佳地，包括：表達(dá)盒1，該表達(dá)盒1包括：啟動子，gif1的編碼基因，終止子；以及表達(dá)盒2，該表達(dá)盒2包括：啟動子，pho1；2的編碼基因，終止子；較佳地，該表達(dá)盒被包含于表達(dá)構(gòu)建物或表達(dá)載體中。

10、在一種或多種實施方式中，所述的c4作物為或所述gif1或pho1；2來自：禾谷類c4作物；較佳地，所述的禾谷類c4作物包括(但不限于)：玉米(zea?mays)，高粱(sorghumbicolor)，谷子(setaria?italica)等。

11、在一種或多種實施方式中，所述pho1；2的編碼基因包括cdna序列、基因組序列，或在它們基礎(chǔ)上人工優(yōu)化或改造的序列。

12、在一種或多種實施方式中，所述gif1的編碼基因包括cdna序列、基因組序列，或在它們基礎(chǔ)上人工優(yōu)化或改造的序列。

13、在一種或多種實施方式中，所述的pho1；2的多肽的氨基酸序列選自下組：(i)具有seq?id?no:1、2或4任一所示氨基酸序列的多肽；(ii)將如seq?id?no:1、2或4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個(如1-20個，1-10個，1-5個，1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述調(diào)控性狀功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列與seq?id?no:1、2或4所示氨基酸序列的同源性≥80％(較佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述調(diào)控性狀功能的多肽；或(iv)在seq?id?no:1、2或4所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加標(biāo)簽序列或酶切位點序列，或在其n末端添加信號肽序列后形成的多肽。

14、在一種或多種實施方式中，所述的gif1的多肽的氨基酸序列選自下組：(i)具有seq?id?no:3或5任一所示氨基酸序列的多肽；(ii)將如seq?id?no:3或5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個(如1-20個，1-10個，1-5個，1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述調(diào)控性狀功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列與seq?id?no:3或5所示氨基酸序列的同源性≥80％(較佳地≥85％，≥90％，≥95％或≥98％)，具有所述調(diào)控性狀功能的多肽；或(iv)在seq?id?no:3或5所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加標(biāo)簽序列或酶切位點序列，或在其n末端添加信號肽序列后形成的多肽。

15、在本發(fā)明的另一方面，提供一種gif1基因和pho1；2基因或其編碼的蛋白的用途，用作鑒定c4作物的性狀的分子標(biāo)記物，或用作定向篩選c4作物的分子標(biāo)記物；所述性狀包括：(i)莖稈顏色、青貯用莖稈的生物量；(ii)莖稈糖含量、莖稈磷含量；(iii)籽粒磷含量；(iv)籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量。

16、在一種或多種實施方式中，通過分析c4作物中g(shù)if1基因和pho1；2基因表達(dá)量或gif1蛋白和pho1；2蛋白活性來確定鑒定c4作物的性狀或進(jìn)行定向篩選。

17、在本發(fā)明的另一方面，提供一種鑒定c4作物的性狀的方法，包括：分析c4作物中g(shù)if1基因和pho1；2基因或其編碼的蛋白的活性；若待測c4作物中g(shù)if1基因和pho1；2基因或其編碼的蛋白活性等于或高于該類c4作物的平均值，則表明其具有優(yōu)良的性狀，所述優(yōu)良的性狀選自：(i)維持莖稈綠色、增加青貯用莖稈的生物量；(ii)增加莖稈糖含量、降低莖稈磷含量；(iii)降低籽粒磷含量；(iv)降低籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量；若待測c4作物中pho1；2基因表達(dá)量或pho1；2蛋白活性低于該類c4作物的平均值，則其性狀不理想。

18、在本發(fā)明的另一方面，提供一種定向選擇性狀改良的c4作物的方法，所述方法包括：分析c4作物中g(shù)if1基因和pho1；2基因或其編碼的蛋白的活性；若待測c4作物中g(shù)if1基因和pho1；2基因或其編碼的蛋白活性等于或高于該類c4作物的平均值，則表明其具有優(yōu)良的性狀，所述優(yōu)良的性狀選自：(i)維持莖稈綠色、增加青貯用莖稈的生物量；(ii)增加莖稈糖含量、降低莖稈磷含量；(iii)降低籽粒磷含量；(iv)降低籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量；將其作為性狀改良的c4作物。

19、在一種或多種實施方式中，所選擇的c4作物gif1基因和pho1；2基因高表達(dá)或gif1蛋白和pho1；2蛋白高活性，較佳地，所述高表達(dá)或高活性，是指與同類或同種c4作物的表達(dá)或活性的平均值相比，表達(dá)或活性具有統(tǒng)計學(xué)意義的提高。

20、在一種或多種實施方式中，所述的增加、增強、促進(jìn)、提高或增強表示顯著性的增加、增強、促進(jìn)、提高或增強，如增加、增強、促進(jìn)、提高或增強20％、40％、60％、80％、90％或更高。

21、在一種或多種實施方式中，所述的降低表示顯著性的降低，如降低20％、40％、60％、80％、90％或更低。

22、在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選改良c4作物性狀的物質(zhì)(潛在物質(zhì))的方法，所述方法包括：(1)將候選物質(zhì)加入到表達(dá)gif1和pho1；2的體系中；(2)檢測所述體系，觀測其中g(shù)if1和pho1；2的表達(dá)或活性，若其表達(dá)或活性提高，則表明該候選物質(zhì)為可用于改良c4作物性狀的物質(zhì)；其中，改良c4作物性狀包括選自下組：(i)維持莖稈綠色、增加青貯用莖稈的生物量；(ii)增加莖稈糖含量、降低莖稈磷含量；(iii)降低籽粒磷含量；(iv)降低籽粒植酸含量或(v)提高籽粒淀粉含量；

23、在一種或多種實施方式中，所述改良的性狀還包括選自下組：(vi)大幅提高產(chǎn)量(如提高50％或以上)；(vii)提高生物量；(viii)提高磷利用率；(ix)提高光合效率。

24、在一種或多種實施方式中，還包括設(shè)置對照組，從而明確分辨測試組中g(shù)if1和pho1；2的表達(dá)或活性與對照組的差異。

25、在一種或多種實施方式中，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對gif1和pho1；2基因或其編碼的蛋白或它們的上游或下游蛋白或基因設(shè)計的調(diào)控分子(如上調(diào)劑、小分子化合物基因編輯構(gòu)建物等。

26、本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。