本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物，具體涉及葡萄糖氧化酶突變體ahgoda-m1及其編碼基因、應(yīng)用、提高葡萄糖氧化酶的酶學(xué)特性的方法。

背景技術(shù)：

1、葡萄糖氧化酶(glucose?oxidase,god)是一種需氧脫氫酶，屬于葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶家族，能專一催化β-d-葡萄糖生成過氧化氫和葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，曲霉和青霉是其主要生產(chǎn)菌株。葡萄糖氧化酶具有促進(jìn)消化吸收，維護(hù)腸道健康，提高機(jī)體免疫力，提高生產(chǎn)性能等功能，是一種良好的抗生素替代物。

2、葡萄糖氧化酶應(yīng)用范圍廣泛，主要包括飼料、食品、醫(yī)藥和能源等行業(yè)。實(shí)際應(yīng)用環(huán)境大都處于高溫條件，現(xiàn)有葡萄糖氧化酶熱穩(wěn)定較差、活力較低，其生產(chǎn)和應(yīng)用受到限制。因此獲得熱穩(wěn)定性優(yōu)良的葡萄糖氧化酶至關(guān)重要。通常情況下，曲霉屬god具有更優(yōu)良的穩(wěn)定性，青霉屬god具有更高的催化活性。因此常常用曲霉來源的god進(jìn)行熱穩(wěn)定性改良研究。

3、蛋白質(zhì)工程是酶分子改良工作的重要手段，通過基因突變或蛋白修飾以改變蛋白結(jié)構(gòu)從而實(shí)現(xiàn)酶功能的改變，主要針對(duì)熱穩(wěn)定性、催化效率、ph穩(wěn)定性和底物特異性等酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行改良。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖氧化酶ahgoda突變體ahgoda-m1。

2、本發(fā)明的再一目的是提供一種葡萄糖氧化酶基因。

3、本發(fā)明的再一目的是提供包括上述葡萄糖氧化酶基因的重組載體。

4、本發(fā)明的再一目的是提供包括上述葡萄糖氧化酶基因的重組菌株。

5、本發(fā)明的再一目的是提供一種制備葡萄糖氧化酶的方法。

6、本發(fā)明的再一目的是提供一種提高葡萄糖氧化酶的酶活、最適溫度和熱穩(wěn)定性的方法。

7、根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，所述野生型葡萄糖氧化酶ahgoda的氨基酸序列如seqidno：1所示。

8、seq?id?no：1

9、phyarrslleanlltdpskvaehtvdyiiagggltgltaaarlsenpnitvlvietgfyesergpiiedlntygdifgttvdhayetvelatnnrtevirsgnglggstlvnggtwtrphkaqidswesvfgndgwnwdtlvayshqvetvrapnekqiaaghyfdpschgqngsvhagprdtgesyspimkalmstvqdqgvpiqqdlscgnphgvsmfpnslneeqtrsdaarewllpnfqrpnlqvltgqrvgkvlldqtgetpqavgvefgthnntkynvyanhevllaagstvsplileysgigmksildsvgietivdlpvglnlqdqtttpvtsritsagdgqgqaayfatfnetfgdyapqahellntklaqwasetvsrggfhnvtaltiqyenyrdwivthdvayselfldtagsisftvwdllpftrgyvhildkdpylhryaynpqyllneldllgqaaacklarelsnsgemqtyfagedvpgdnlaydaglddwaeyirynfrpnyhgvgtcsmmpkelggvvdstarvygvqglrvidgsipptqvsahvmtvfygmalkvseavledyaasl

10、編碼上述野生型葡萄糖氧化酶ahgoda的葡萄糖氧化酶基因的ahgoda核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

11、seq?id?no：2

12、ccacattacgctagaagatccttgttggaagctaacttgttgactgatccatctaaggttgctgaacatactgttgattacattatcgccggtggtggtttgactggtttgactgctgctgctagattgtctgaaaacccaaacattactgttttggtcattgagactggtttttacgaatctgagagaggtccaattattgaggatttgaacacttacggtgacatcttcggtactactgttgatcatgcttacgaaactgttgaattggctactaacaacagaactgaagttattcgttctggcaacggtttgggtggttctactttggttaacggtggtacttggactagaccacataaggctcaaattgattcttgggaatctgtttttggtaacgacggttggaactgggatactttggttgcttactctcatcaagttgaaactgttagagctccaaacgaaaagcaaattgctgctggtcattactttgatccatcttgtcatggtcaaaacggttctgttcatgctggtccaagagatactggtgaatcttactctccaattatgaaggctttgatgtctactgttcaagaccaaggtgttccaattcaacaagatttgtcttgtggtaatccacatggtgtttctatgtttccaaactctttgaacgaagagcaaactcgttctgacgccgctagagaatggttgttgccaaactttcaaagaccaaacttgcaagttttgaccggtcaaagagttggtaaggttttgttggatcaaactggtgaaactccacaagctgttggtgttgaatttggtactcataacaacactaagtacaacgtctacgccaaccatgaagttttgttggctgctggttctactgtttctccattgattttggaatactccggtattggtatgaagtccattttggattctgttggcattgagactattgtcgatttgccagttggtttgaacttgcaagatcaaactactactccagttacttctagaattacctctgctggtgatggtcaaggtcaagctgcttactttgctacttttaacgaaacttttggtgactacgccccacaagctcatgaattgttgaacactaagttggctcaatgggcttctgaaactgtttctagaggtggttttcataacgttactgctttgactattcagtacgaaaactacagagattggattgtcactcacgatgtcgcctactctgaattgtttttggatactgctggttctatttcctttaccgtttgggatttgttgccatttactcgtggttacgttcatattttggataaggatccatacttgcaccgttacgcttacaacccacaatacttgttgaacgaattggatttgttgggccaagctgctgcttgtaagttggctagagaattgtctaactctggtgaaatgcaaacttactttgccggtgaagatgttccaggtgataacttggcttacgatgctggtttggatgattgggctgaatacattagatacaactttcgtccaaactaccacggtgttggtacttgttctatgatgccaaaggaattgggtggtgttgttgattctactgctagagtttacggtgttcaaggtttgagagttattgatggttctattccaccaactcaagtttctgctcatgttatgactgttttctacggtatggctttgaaggtttctgaagctgttttggaagattacgctgcttctttg

13、根據(jù)本發(fā)明的葡萄糖氧化酶突變體ahgoda-m1的氨基酸序列如seq?id?no：3所示，即對(duì)葡萄糖氧化酶ahgoda的第72位和第153位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變而得，t72r&a153p。

14、seq?id?no：3

15、

16、所述葡萄糖氧化酶突變體編碼基因ahgoda-m1的核苷酸序列如seq?id?no：4所示。

17、seq?id?no：4

18、

19、ctgttttggaagattacgctgcttctttgtaa

20、根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明還提供包含上述野生型和突變體基因的重組載體，采用over-lap?pcr的方法擴(kuò)增所述野生型和突變體序列片段，將野生型和突變體序列片段克隆到表達(dá)載體ppiczαa上，構(gòu)建重組載體；將本發(fā)明的葡萄糖氧化酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。

21、作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將葡萄糖氧化酶基因插入到質(zhì)粒ppiczαa上的ecor?i和not?i限制性酶切位點(diǎn)之間，得到重組表達(dá)質(zhì)粒ppiczαa-ahgoda和ppiczαa-ahgoda-m1。

22、本發(fā)明還提供了包含上述葡萄糖氧化酶基因的重組菌株，將重組表達(dá)質(zhì)粒用bglⅱ限制性內(nèi)切酶線性化，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母gs115感受態(tài)細(xì)胞，30℃培養(yǎng)48h。挑取在ypd平板上生長得到的轉(zhuǎn)化子于his-mm平板上誘導(dǎo)表達(dá)，后經(jīng)顯色篩選得到葡萄糖氧化酶重組菌株gs115/ahgoda、ahgoda-m1。

23、本發(fā)明還提供了一種制備葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟：

24、用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；

25、培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組葡萄糖氧化酶表達(dá)；

26、回收并純化所表達(dá)的突變酶。

27、本發(fā)明還提供了上述葡萄糖氧化酶突變體的應(yīng)用。

28、根據(jù)本發(fā)明的提高葡萄糖氧化酶的酶活、最適溫度和熱穩(wěn)定性的方法，包括將氨基酸序列如seq?id?no：1所示的葡萄糖氧化酶ahgoda的第72位和第153位氨基酸進(jìn)行t72r、a153p定點(diǎn)突變。

29、本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高酶活力與優(yōu)熱穩(wěn)定性的、適合于在食品、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的葡萄糖氧化酶。本發(fā)明的突變體酶活力由112u/mg提高到166u/mg，提高幅度為48％；最適溫度由40℃提高到50℃；70℃處理30min后保留約33％的剩余活性，能更好的滿足食品、飼料以及紡織工業(yè)等領(lǐng)域中應(yīng)用的需求，有著非常廣闊的應(yīng)用前景。