本發(fā)明屬于生物制藥和生物化工，具體涉及重組酸性磷酸酶工程菌及在制備5’-胞苷酸中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、5’-胞苷酸是一種重要的核苷酸原料和中間體，可作為食品添加劑、藥品以及藥物中間體應(yīng)用于不同領(lǐng)域，5’-胞苷酸在成年人、嬰幼兒及哺乳動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，含有5’-胞苷酸的嬰幼兒奶粉能顯著提高嬰幼兒的免疫力，功效更接近于母乳，5’-胞苷酸作為制備核苷酸藥物及核苷酸衍生物的重要中間體，主要用于制備胞苷三磷酸、胞二磷膽堿鈉、阿糖胞苷酸和聚肌胞苷酸等。

2、目前，生產(chǎn)5’-胞苷酸的方法主要有兩種；一種是利用核酸水解酶水解從酵母中提取的核糖核酸獲得5’-胞苷酸；此方法中酵母中提取的核糖核苷經(jīng)核酸酶水解后得到的是4種5’-核苷酸即5’-腺苷酸、5’-鳥苷酸、5’-胞苷酸和5’-尿苷酸混合物，后經(jīng)多次離子交換樹脂進(jìn)行分離獲得5’-胞苷酸粗品，再通過精制得到5’-胞苷酸成品；

3、此方法存在以下缺點(diǎn)：

4、1、此工藝生產(chǎn)周期較長、分離純化工序復(fù)雜繁多。

5、2、收率不高，致使生產(chǎn)成本較高。

6、3、生產(chǎn)過程中帶來大量廢水，環(huán)保壓力較大，同時影響產(chǎn)能。

7、另一種方法是通過化學(xué)法磷酸化胞苷獲得5’-胞苷酸，流程如下所示：

8、

9、此方法存在以下缺點(diǎn)：

10、1、此方法中磷酸化試劑通常為三氯氧磷等危險(xiǎn)化學(xué)品，生產(chǎn)過程中帶來的安全隱患較多；

11、2、此方法生產(chǎn)過程中的三廢較多、企業(yè)環(huán)保壓力較大；

12、3、此方法生產(chǎn)出的5’-胞苷酸產(chǎn)品還無法應(yīng)用于食品添加劑領(lǐng)域比如嬰幼兒奶粉。

13、近年來，廣大生物化學(xué)工作者一直在探索一種溫和、高效、經(jīng)濟(jì)以及對環(huán)境友好5’-胞苷酸合成方法來替代現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝；生物工作者對此化合物作了一些嘗試(chinese?journal?of?biotechnology；issn?1000-3061,cn?11-1998/q)，利用尿苷-胞苷激酶和聚磷酸激酶偶聯(lián)催化胞苷制備5’-胞苷酸，反應(yīng)式如下：

14、

15、目前此方法還存在底物濃度低、轉(zhuǎn)化不完全、輔料atp價(jià)格昂貴等缺陷，離產(chǎn)業(yè)化還有一定距離，為此本發(fā)明提出重組酸性磷酸酶工程菌及在制備5’-胞苷酸中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供重組酸性磷酸酶工程菌及在制備5’-胞苷酸中的應(yīng)用，所述重組酸性磷酸酶工程菌通過發(fā)酵制備的酸性磷酸酶能夠高效地催化胞苷和焦磷酸鈉合成5’-胞苷酸，解決目前5’-胞苷酸生產(chǎn)過程中遇到的步驟復(fù)雜、收率不理想、成本偏高、環(huán)境污染嚴(yán)重且存在安全隱患的問題。

2、為此，本發(fā)明提供一種重組酸性磷酸酶工程菌，所述重組酸性磷酸酶工程菌是將seq?id?no.1所示acid?phosphatase基因構(gòu)建至質(zhì)粒pet28a中并轉(zhuǎn)入大腸桿菌bl21(de3)獲得的，該菌株于2024年5月9日提交廣東省微生物菌種保藏中心(gdmcc)予以保藏，保藏編號為：gdmcc?no：64595，保藏地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓，菌株名稱為escherichia?coli?hm-ap。

3、優(yōu)選地，所述重組酸性磷酸酶工程菌seq?id?no.1所示acid?phosphatase基因(ncbi登錄號為dafyeb010000010.1)來自微生物enterobacter?aerogenes(菌株編號atcc13048)。

4、其中，所述seq?id?no.1所示的序列結(jié)構(gòu)如下：

5、atgaaaaagc?gcgttctcgc?cctctgcctc?gccagcctgt?tttccgttaa?cgctttcgcg

6、ctggtccctg?ccggcaacga?ggcgaccacc?aaaccagatc?tctattatct?gaaaaatgca

7、caggccatcg?atagcctggc?gctgttgccg?ccgccgccgg?aagttggcag?catcgcattt

8、ttaaacgatc?aggcgatgta?tgagaaagga?cggctgttgc?gcaataccga?acgtggcaag

9、ctggcggctg?aagatgctaa?cctgagcgcc?ggcggcgtcg?cgaatgcctt?ctccagcgct

10、tttggttcgc?ccatcaccga?aaaagacgcg?ccgcagttac?ataagctgct?gacaaatatg

11、attgaggatg?ccggcgatct?ggccacccgc?agcgcgaaag?agaaatatat?gcgcattcgc

12、ccgtttgcgt?tctacggcgt?ttcaacctgt?aacactaccg?agcaggacaa?gctgtcgaaa

13、aacggatctt?acccttccgg?ccatacctct?atcggttggg?caaccgcgct?ggtactggcg

14、gagatcaatc?cgcagcggca?aaacgaaatt?ctcaaacgcg?gctatgagtt?gggcgaaagc

15、cgggttatct?gcggctatca?ttggcagagc?gatgtcgatg?cggcgcggat?agtcggctcg

16、gcggtggtgg?cgaccctgca?taccaacccg?gccttccaac?agcagttgca?gaaagcaaag

17、gatgaattcg?ccaaaacgca?gaagtaa

18、其中，微生物enterobacter?aerogenes(菌株編號atcc?13048)為市售菌株。

19、優(yōu)選地，所述重組酸性磷酸酶工程菌重組質(zhì)粒pet28a-acid?phosphatase通過以下步驟構(gòu)建得到：將seq?id?no.1所示acid?phosphatase基因構(gòu)建至質(zhì)粒pet28a通過以下步驟得到：以具有seq?id?no.2所示的序列結(jié)構(gòu)的acid?phosphatase_ndei_f和具有seq?idno.3所示的序列結(jié)構(gòu)的acid?phosphatase_xhoi_r作為引物，以enterobacter?aerogenes基因組為模板，克隆acid?phosphatase基因，進(jìn)行ndei/xhoi雙酶切，回收后的基因片段與ndei/xhoi雙酶切的質(zhì)粒pet28a通過t4dna連接酶進(jìn)行連接，即得重組質(zhì)粒pet28a-acidphosphatase。

20、其中，所述seq?id?no.2所示的序列結(jié)構(gòu)如下：

21、gggaattccatatgaaaaagcgcgtt。

22、其中，所述seq?id?no.3所示的序列結(jié)構(gòu)如下：

23、ccgctcgagttacttctgcgttttgg。

24、其中，ndei酶、xhoi酶、pet28a質(zhì)粒均為市售產(chǎn)品。

25、優(yōu)選地，所述重組酸性磷酸酶工程菌pet28a-acid?phosphatase-bl21(de3)通過以下步驟得到：取1ul重組質(zhì)粒pet28a-acid?phosphatase加入至冰上解凍的大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰浴30min后在42℃水浴中熱擊90s后迅速置于冰浴5min；加入800ul?lb液體培養(yǎng)基后于37℃，200rpm/min搖床中振蕩培養(yǎng)1h；取100ul培養(yǎng)液涂布在含有卡那霉素的固體lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)10～20h，長出的菌落即為重組工程菌pet28a-acidphosphatase-bl21(de3)。

26、其中，bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞為市售菌株。

27、優(yōu)選地，重組酸性磷酸酶工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶液步驟如下：將所述的重組酸性磷酸酶工程菌pet28a-acid?phosphatase-bl21(de3)的單菌落接種至含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩培養(yǎng)8～16h，以1％接種量轉(zhuǎn)接至tb培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩發(fā)酵培養(yǎng)至od600值達(dá)到0.8～1.0，加入誘導(dǎo)劑iptg，使iptg的終濃度為0.5mmol/l，降溫至30℃，誘導(dǎo)12～20h；發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后離心收集細(xì)胞，自來水重懸細(xì)胞后于冰浴中進(jìn)行超聲波破碎細(xì)胞，將破碎液進(jìn)行離心，收集上清液即得到重組酸性磷酸酶酶液。

28、其中，所述的lb培養(yǎng)基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast?extract)5g/l，氯化鈉(nacl)10g/l；121℃滅菌20min。

29、其中，所述的tb培養(yǎng)基：胰蛋白胨(tryptone)12g/l，酵母提取物(yeast?extract)24g/l，甘油4g/l，磷酸二氫鉀2.31g/l，磷酸氫二鉀12.54g/l；121℃滅菌20min。

30、本發(fā)明提供一種重組酸性磷酸酶工程菌及其在制備5’-胞苷酸中的應(yīng)用，其中，所述5’-胞苷酸結(jié)構(gòu)式如下：

31、

32、所述制備5’-胞苷酸的步驟如下：以重組酸性磷酸酶工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酶液為催化劑，在水中35℃～40℃下，ph4.0～5.0條件下催化胞苷和焦磷酸鈉合成5’-胞苷酸，反應(yīng)結(jié)束后加熱至80～90℃、保溫?cái)嚢?0min～1h過濾，濾液攪拌降溫至4～10℃，氫氧化鈉溶液調(diào)ph8.0后析鹽16～20h，過濾分離后清液進(jìn)行減壓蒸餾濃縮，濃縮至胞苷酸濃度200～300g/l，加入無水乙醇，在0～4℃下攪拌結(jié)晶10～20h，過濾分離得到的固體即為5’-胞苷酸粗品，粗品進(jìn)一步精制、干燥，即獲得5’-胞苷酸成品。

33、其中，胞苷的濃度為50～100g/l，焦磷酸鈉濃度為100～200g/l。

34、其中，加入無水乙醇的量為濃縮液體積的2～3倍。

35、優(yōu)選地，本發(fā)明所述粗品進(jìn)一步精制的步驟如下：將5’-胞苷酸粗品加入純水中，溶解后加入活性炭脫色，過濾，用稀鹽酸溶液調(diào)節(jié)ph值為3.0～4.0，向溶液中加入2～3倍體積的無水乙醇，在0℃～4℃下結(jié)晶10～20h，固液分離，固體干燥后即為5’-胞苷酸成品。

36、本發(fā)明所述制備5’-胞苷酸的反應(yīng)式如下：

37、

38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

39、1、本發(fā)明構(gòu)建的重組酸性磷酸酶工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的酸性磷酸化酶對胞苷的催化能力較強(qiáng)，可以高效地制備5’-胞苷酸，提供了一種新型制備5’-胞苷酸的綠色酶催化工藝。

40、2、本發(fā)明重組酸性磷酸酶制備5’-胞苷酸工藝反應(yīng)步驟簡單，水相溫和的綠色合成工藝有利于產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

41、3、本發(fā)明重組酸性磷酸酶制備5’-胞苷酸工藝，生物轉(zhuǎn)化的底物胞苷濃度可以達(dá)到100g/l，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，收率高，有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。

42、4、本發(fā)明重組酸性磷酸酶制備5’-胞苷酸工藝，以價(jià)格低廉的焦磷酸鈉作為磷源供體，極大地降低了生產(chǎn)成本。