本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種耐堿性fc結(jié)合蛋白protein?a及其用于在抗體或fc融合蛋白純化中作為親和層析填料配基的用途。

背景技術(shù)：

1、用于親和色譜的fc結(jié)合蛋白-金黃色葡萄球菌蛋白a(staphylococcal?proteina，簡(jiǎn)稱(chēng)spa或protein?a、蛋白a)是金黃色葡萄球菌表面的一種蛋白質(zhì)，通過(guò)共價(jià)鍵連接到胞壁肽聚糖。由于能和人及多種哺乳動(dòng)物igg的fc段結(jié)合，蛋白a與抗體的fc段結(jié)合并不影響抗體對(duì)抗原的吸附活性，因此被廣泛應(yīng)用于抗體的親和純化。

2、野生型蛋白a基因編碼序列由1464個(gè)堿基組成(不包括編碼n端信號(hào)肽的108個(gè)堿基)，共編碼488個(gè)氨基酸，分子量約為42kd左右。蛋白a不含有半胱氨酸，因此分子內(nèi)部沒(méi)有二硫鍵和巰基，屬于一種單鏈多肽，通過(guò)共價(jià)鍵和金黃色葡萄球菌的肽聚糖連接。蛋白a包括e、d、a、b、c為5個(gè)高度同源的igg結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們之間約有65％～90％的同源性，每個(gè)結(jié)構(gòu)域由大約58個(gè)氨基酸組成呈z型的3個(gè)α螺旋束反向平行排列(分別為螺旋h1，h2，h3)，其三維結(jié)構(gòu)通過(guò)疏水核穩(wěn)定。

3、單個(gè)結(jié)構(gòu)域均具備自主結(jié)合抗體igg?fc片段能力，但是這種天然的蛋白a配體由于其穩(wěn)定性和洗脫條件等問(wèn)題而使其應(yīng)用受到限制。蛋白a容易被微生物降解，對(duì)有機(jī)溶劑及ph的變化敏感，使得色譜柱的使用壽命變短；蛋白a親和填料純化igg后需要在較低ph環(huán)境中才能洗脫下來(lái)，這會(huì)降低igg的生物活性；在親和分離過(guò)程中，蛋白a會(huì)從色譜柱上解脫下來(lái)，需要進(jìn)一步純化去除。

4、通常單抗純化第一步所用的層析介質(zhì)，就是層析介質(zhì)材料與蛋白a偶聯(lián)所得，由于其專(zhuān)一結(jié)合igg，通常一步純化后純度和收率均可以達(dá)到90％以上，但是這種層析介質(zhì)價(jià)格昂貴且不耐用，每次層析步驟后必須要進(jìn)行清潔，以去除由發(fā)酵培養(yǎng)引入的宿主蛋白、宿主dna等其他強(qiáng)吸附的雜質(zhì)，目前最有效的清洗方式是0.5m氫氧化鈉洗滌，但是使用強(qiáng)堿洗滌，交聯(lián)于層析介質(zhì)材料上protein?a容易發(fā)生水解變性或脫落，堿處理多批次后，因protein?a脫落及蛋白變性水解可導(dǎo)致蛋白載量顯著下降，給生產(chǎn)工藝穩(wěn)健性帶來(lái)較大的挑戰(zhàn)。

5、目前國(guó)內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)對(duì)protein?a進(jìn)行突變改造，獲得了一些耐堿性較強(qiáng)的protein?a，如ge?healthcare在專(zhuān)利申請(qǐng)us20200079878a1中指出，通過(guò)突變篩選獲得了多個(gè)耐堿洗較強(qiáng)的protein?a片段，在0.5m?naoh堿洗300次，抗體載量仍能維持50％左右。專(zhuān)利申請(qǐng)cn104059133a在蛋白a的b結(jié)構(gòu)域基礎(chǔ)上進(jìn)行突變篩選，獲得的突變體經(jīng)0.5mnaoh堿洗100次(約25h)，載量無(wú)明顯變化。

6、在抗體純化工藝中，親和層析填料成本比較高，與離子交換填料、反相層析填料等層析填料相比，目前的protein?a耐堿性仍有較大的提升空間，仍需要一種耐堿性更優(yōu)良的親和蛋白a分子作為親和層析的配基。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)以上技術(shù)現(xiàn)狀，本發(fā)明通過(guò)突變篩選，提供了耐堿性更優(yōu)良的fc結(jié)合蛋白protein?a。具體發(fā)明如下：

2、本發(fā)明提供了一種耐堿性fc結(jié)合蛋白protein?a的z結(jié)構(gòu)域，其中所述z結(jié)構(gòu)域?yàn)閟eq?id?no:6所示的氨基酸序列。

3、本發(fā)明還提供了一種含有所述z結(jié)構(gòu)域的耐堿性protein?a；作為實(shí)施方案之一，所述protein?a包含2～8個(gè)重復(fù)的z結(jié)構(gòu)域；本發(fā)明中，作為實(shí)施方案之一，所述protein?a包含3～6個(gè)重復(fù)的z結(jié)構(gòu)域；本發(fā)明中，作為實(shí)施方案之一，所述protein?a包括4-6個(gè)重復(fù)的z結(jié)構(gòu)域，例如包括4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)重復(fù)的z結(jié)構(gòu)域。

4、本發(fā)明中，作為實(shí)施方案之一，所述protein?a的c末端進(jìn)一步連接一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，優(yōu)選一個(gè)半胱氨酸。

5、本發(fā)明中，作為實(shí)施方案之一，所述protein?a具有seq?id?no:14或seq?id?no:17所示的氨基酸序列。

6、相應(yīng)地，本發(fā)明還要求保護(hù)所述的z結(jié)構(gòu)域或protein?a的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明提供的氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易得到相應(yīng)的核苷酸序列，并可根據(jù)不同生物的密碼子特性對(duì)其核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化。

7、相應(yīng)地，本發(fā)明還要求保護(hù)包含所述核苷酸序列的表達(dá)載體。

8、相應(yīng)地，本發(fā)明還要求保護(hù)包含所述表達(dá)載體或其基因組中整合有前述z結(jié)構(gòu)域或protein?a的核苷酸序列的宿主細(xì)胞。

9、通過(guò)將所述核苷酸序列插入到合適的表達(dá)載體，并進(jìn)一步轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞可得到用于表達(dá)所述protein?a的重組表達(dá)菌株，用于所述protein?a的生產(chǎn)；所述表達(dá)載體優(yōu)選大腸桿菌表達(dá)載體pet-29a(+)，所述宿主細(xì)胞優(yōu)選大腸桿菌bl21(de3)細(xì)胞。

10、本發(fā)明還提供了一種親和吸附介質(zhì)，其中前述的protein?a偶聯(lián)至固相載體。作為實(shí)施方案之一，所述固相載體選自天然或經(jīng)改造的聚合物，如瓊脂糖、葡聚糖等；或者合成的聚合物，如聚甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯-二乙烯基苯等；或者無(wú)機(jī)物基質(zhì)的載體，如陶瓷、二氧化硅等。作為實(shí)施方案之一，所述固相載體的形式包括微球、磁珠、濾膜、芯片、或毛細(xì)管。

11、本發(fā)明還提供了前述的親和吸附介質(zhì)用于抗體或fc融合蛋白純化、用于制備治療臨床自身免疫性疾病或其它與人體內(nèi)ig相關(guān)的疾病的治療劑的用途；所述臨床自身免疫性疾病或其它與人體內(nèi)ig相關(guān)的疾病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡/狼瘡性腎炎、抗腎小球基膜抗體疾病、抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎、腎移植排斥反應(yīng)、膜增殖性腎炎、過(guò)敏性紫癜腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、硬皮病、皮肌炎、天胞瘡、擴(kuò)張型心肌病等。

12、本發(fā)明還提供了前述protein?a用于在抗體或fc融合蛋白純化中作為親和層析填料配基的用途。作為示例性的說(shuō)明，本發(fā)明所述的protein?a的親和層析填料配基可用無(wú)菌氫氧化鈉或飽和碳酸鈉或飽和碳酸氫鈉溶液清洗和消毒，延長(zhǎng)吸附柱的使用壽命。

13、技術(shù)效果：

14、1、本發(fā)明獲得的protein?a突變體蛋白可作為親和層析填料配基，耐堿性?xún)?yōu)良，其中，(2953)-4、(2953)-6層析介質(zhì)在使用1m?naoh累計(jì)清洗120min，0.5m?naoh累計(jì)清洗100h，dbc無(wú)明顯下降，仍可保持初始載量的98％，層析收率可保持在90％以上；兩款層析介質(zhì)在1m?naoh溶液中浸泡100h內(nèi)，載量保留率仍有80％以上。耐堿性顯著優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)us20200079878a1公開(kāi)的耐堿性protein?a。

15、2、本發(fā)明獲得的protein?a突變體蛋白具有良好的耐高溫性能，(2953)-4和(2953)-6兩款層析介質(zhì)在121℃高溫滅菌30min?1次后，剩余dbc保持在初始值的83％以上，121℃高溫滅菌30min?2次后，剩余dbc仍可保持在初始值的75％以上。

技術(shù)特征：

1.一種耐堿性fc結(jié)合蛋白protein?a的z結(jié)構(gòu)域，其特征在于，所述z結(jié)構(gòu)域?yàn)閟eq?idno:6所示的氨基酸序列。

2.含有權(quán)利要求1所述z結(jié)構(gòu)域的protein?a，其特征在于，protein?a包括2～8個(gè)、優(yōu)選3～6個(gè)、最優(yōu)選4-6個(gè)重復(fù)的z結(jié)構(gòu)域。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的protein?a，其特征在于，所述protein?a的c末端進(jìn)一步連接一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，優(yōu)選一個(gè)半胱氨酸。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的protein?a，其特征在于，所述protein?a為seq?id?no:14或seq?id?no:17所示的氨基酸序列。

5.編碼權(quán)利要求1所述的z結(jié)構(gòu)域或權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的protein?a的核苷酸序列。

6.包含如權(quán)利要求5所述核苷酸序列的表達(dá)載體。

7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，或其基因組中整合有權(quán)利要求5所述的核苷酸序列。

8.一種親和吸附介質(zhì)，其特征在于，所述親和吸附介質(zhì)的固相載體中偶聯(lián)有權(quán)利要求2-4任一項(xiàng)所述的protein?a。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的親和吸附介質(zhì)，其特征在于，所述固相載體選自天然或經(jīng)改造的聚合物，優(yōu)選瓊脂糖或葡聚糖；或者合成的聚合物，優(yōu)選聚甲基丙烯酸酯或聚苯乙烯-二乙烯基苯；或者無(wú)機(jī)物基質(zhì)的載體，優(yōu)選陶瓷或二氧化硅。

10.權(quán)利要求8所述的親和吸附介質(zhì)用于抗體或fc融合蛋白純化、用于制備治療臨床自身免疫性疾病或其它與人體內(nèi)ig相關(guān)的疾病的治療劑的用途。

11.權(quán)利要求2-4所述的protein?a用于在抗體或fc融合蛋白純化中作為親和層析填料配基的用途。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種耐堿性Fc結(jié)合蛋白protein?A的Z結(jié)構(gòu)域及包含該結(jié)構(gòu)域的protein?A，所述Z結(jié)構(gòu)域?yàn)镾EQ?ID?NO:6所示的氨基酸序列。本發(fā)明獲得的突變體蛋白可作為親和層析填料配基，耐堿性?xún)?yōu)良，同時(shí)具有良好的耐高溫性能。鍵合本發(fā)明protein?A的層析介質(zhì)在使用1M?NaOH累計(jì)清洗120min，0.5M?NaOH累計(jì)清洗100h，DBC無(wú)明顯下降，仍可保持初始載量的98％；在121℃高溫滅菌30min?1次后，剩余DBC保持在初始值的83％以上，121℃高溫滅菌30min?2次后，剩余DBC仍可保持在初始值的75％以上，具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：劉合棟,武振軍,張雅雯,李素雯,曹春來(lái),全明景,楊曉純,周翠,何秀儀,李張萬(wàn)金,王嘉鈺
受保護(hù)的技術(shù)使用者：聯(lián)邦生物科技（珠海橫琴）有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9