本技術(shù)涉及一種經(jīng)糖基修飾的融合蛋白、核酸分子、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞及應(yīng)用，涉及生物制藥。

背景技術(shù)：

1、適應(yīng)性免疫應(yīng)答通常分為兩大類：主要由循環(huán)抗體介導(dǎo)的體液免疫和由各種形式的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫。當(dāng)宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原產(chǎn)生了耐受性，腫瘤抗原被識別為“自身抗原”，不被抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting?cells，apc)識別，無法激活免疫系統(tǒng)來對抗腫瘤疾病，因此，將“新抗原”引入免疫系統(tǒng)是治療癌癥的一種方法。

2、前列腺癌(prostate?cancer，pca)為世界上男性最高發(fā)的惡性腫瘤之一，目前雄激素剝奪療法(adt)仍舊是晚期治療的主要手段。但這類患者常常會獲得轉(zhuǎn)移性或者去勢抵抗性，使腫瘤進(jìn)展為惡行程度更高、預(yù)后更差的去勢抵抗性前列腺癌(crpc)。目前已有多種雄激素受體阻滯劑(ar)相繼被fda批準(zhǔn)，用于治療crpc，但療效仍舊有限；此外，靶向前列腺腺癌標(biāo)志物，如psma、pap等的抗體藥物偶聯(lián)物(adc)、嵌合抗原受體t細(xì)胞(car-t)等新型藥物也在不斷的進(jìn)展中，作為前列腺癌治療的替代手段。前列腺腺癌患者的傳統(tǒng)或新型治療仍舊具有巨大的挑戰(zhàn)性，“重組”或“再激活”機(jī)體的免疫應(yīng)答，或許可使前列腺癌患者治愈具有全新的契機(jī)。

3、樹突狀細(xì)胞(dentritic?cell，dc)是功能最強(qiáng)大的apc，是腫瘤抗原特異t淋巴細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答啟動的重要環(huán)節(jié)。將腫瘤抗原與抗體形成復(fù)合物后，抗體分子的fc片段與fc受體有較高的親和力，使得與抗體結(jié)合的腫瘤抗原更容易與apc結(jié)合，激活b淋巴細(xì)胞和t淋巴細(xì)胞，引起體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。如卵巢癌mab-b43.13，psa抗體或hbv抗體抗原復(fù)合物，更易被apc或dc識別，經(jīng)抗原遞呈后激活免疫殺傷。

4、人類fcγriia(hfcγriia)是一種激活型fc受體，當(dāng)fcγriia與抗體fc段結(jié)合時(shí)，可傳遞激活信號，介導(dǎo)fc段效應(yīng)因子功能，包括細(xì)胞溶解、吞噬、脫顆粒和細(xì)胞因子的產(chǎn)生；同時(shí)，fcγriia可對樹突細(xì)胞成熟和抗原遞呈進(jìn)行調(diào)控，介導(dǎo)t細(xì)胞記憶效應(yīng)，參與刺激保護(hù)性的cd8+t細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)了對病毒感染的長期保護(hù),從而達(dá)到即清除靶細(xì)胞，又維持持久免疫保護(hù)的效果。

5、為了深入了解fc片段和fcγriia的結(jié)合，許多研究者對fc片段的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造。有研究者發(fā)現(xiàn)fc片段突變(g236a)在抑制fcγriib的基礎(chǔ)上選擇性激活fcγriia(兩者具有96％的序列一致性)，提高由單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的adcp。在fc片段的s239d/i332e突變中添加g236a可使fcγriia的結(jié)合提高70倍，fcγriia/fcγriib的結(jié)合比(激活/抑制比)提高13倍，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞對抗體包被靶細(xì)胞的吞噬作用(richards?j?o,k.s.,lazar?g?a,et?al.molecular?cancer?therapeutics,2008,7(8):2517-2527.,optimization?of?antibody?binding?to?fcγriia?enhances?macrophage?phagocytosisof?tumor?cells[j].molecular?cancer?therapeutics,2008.7(8):p.2517-2527)。還有研究者發(fā)現(xiàn)fc突變誘導(dǎo)了cd8+和cd4+t細(xì)胞的t細(xì)胞反應(yīng)的激活(bournazos,s.et?al.fc-optimized?antibodies?elicit?cd8?immunity?to?viral?respiratory?infection,nature,vol?588?17december?2020)。因此，對fc片段的改造可能影響fc片段的效應(yīng)功能，從而改變抗體的生物活性。

6、昆蟲糖基化途徑與高等真核生物不同，一般表達(dá)的重組n糖蛋白的糖鏈?zhǔn)呛唵蔚?、沒有唾液酸化的高/低甘露糖型，而不是哺乳動物在相同糖基化位置產(chǎn)生的唾液酸化的復(fù)合型糖鏈。這可能是由于其細(xì)胞具有高n-乙酰氨基葡萄糖苷酶活性、低糖基轉(zhuǎn)移酶活性及較少糖-核苷來源。免疫球蛋白g(igg)抗體的片段可結(jié)晶(fc)區(qū)引發(fā)的效應(yīng)器功能會因天冬酰胺-297(asn-297)處末端唾液酸(sia)殘基的存在而發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，高唾液酸化會阻礙的與自然殺傷細(xì)胞(nk)上的fcγriiia的結(jié)合，導(dǎo)致adcc效力降低。sf9細(xì)胞表達(dá)的沒有末端唾液酸殘基的糖鏈也可以和甘露糖受體(cd206)結(jié)合，這可能增加了樹突狀細(xì)胞對糖蛋白的攝取和處理能力，從而增強(qiáng)了免疫反應(yīng)(scallon?b?j,tam?s?h,mccarthy?s?g,et?al.higher?levels?of?sialylated?fc?glycans?in?immunoglobulin?gmolecules?canadversely?impact?functionality[j].molecular?immunology,2007,44(7):1524-1534.)。

7、除了大量的人的免疫球蛋白，非人源化的抗體加抗原作為治療型疫苗也已經(jīng)有成功的例子，比如ca-125+小老鼠的igg1，oregovomab(m.brewer,r.angioli,g.scambia,etal.,front-line?chemo-immunotherapy?with?carboplatin-paclitaxel?usingoregovomab?indirect?immunization?in...,gynecologic?oncology,https://doi.org/10.1016/j.ygyno.2019.12.024)，這個(gè)例子表明小鼠的igg可以增加其攜帶的抗原的免疫應(yīng)答。有的研究者把小鼠igg1的fc片段直接接上各種抗原，比如hbv-mfc，也已經(jīng)產(chǎn)生了不錯(cuò)的效果(allan?ma?et?al.a?dendritic?cell?receptor-targeted?chimericimmunotherapeutic?protein(c-hbv)for?the?treatment?of?chronic?hepatitis?b,human?vaccines&immunotherapeutics2020,vol.16,no.4,756–778)。

8、相對文獻(xiàn)中有許多對人的免疫球蛋白的fc片段進(jìn)行改造的報(bào)道，然而對小鼠的免疫球蛋白fc片段的改造的報(bào)道相對較少，工程改造能不能增加遞呈效應(yīng)，我們認(rèn)為有必要進(jìn)行小鼠免疫球蛋白的fc片段的工程改造的研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供一種經(jīng)糖基修飾的融合蛋白，包括鼠源fc變體和前列腺癌腫瘤抗原，其中，鼠源fc變體是通過對鼠源igg1?fc片段進(jìn)行改造后得到的，有助于提高鼠源fc片段與dc細(xì)胞的結(jié)合和dc活化，包括特異性t細(xì)胞的增殖和活化。

2、本技術(shù)還提供一種編碼上述融合蛋白的核酸分子，以及包括該核酸分子的表達(dá)載體、宿主細(xì)胞。

3、本技術(shù)還提供一種上述融合蛋白在治療前列腺癌方面的應(yīng)用。

4、本技術(shù)第一方面提供一種經(jīng)糖基修飾的融合蛋白，包含鼠源fc變體和前列腺癌腫瘤抗原，所述融合蛋白提高與dc細(xì)胞的結(jié)合和dc活化，包括特異性t細(xì)胞的增殖和活化；

5、所述鼠源fc變體是對鼠源fc片段進(jìn)行氨基酸突變和非哺乳動物糖基化修飾后得到的；

6、所述鼠源fc變體包括第223位的丙氨酸、第228位的丙氨酸、第230位的丙氨酸、第330位的亮氨酸、第332位的谷氨酸中的至少一種；

7、所述非哺乳動物糖基化修飾不包括唾液酸修飾；

8、氨基酸的位點(diǎn)編號依照eu?numbering系統(tǒng)進(jìn)行。

9、在本技術(shù)提供的方案中，鼠源fc變體是以seq?id?no:1所示的野生型鼠源fc片段為基礎(chǔ)，經(jīng)過氨基酸突變和非哺乳動物糖基化修飾后得到的。

10、此外，seq?id?no:1所示的野生型鼠源fc段為鼠源igg1的fc段，除igg1的fc段，其他鼠源igg的fc段均適用于本技術(shù)；例如，當(dāng)以鼠源igg2的fc段為基礎(chǔ)，經(jīng)過氨基酸突變和非哺乳動物糖基化修飾后得到fc變體具有相似的提高與dc細(xì)胞的結(jié)合和dc活化的效果。

11、在一種具體實(shí)施方式中，所述鼠源fc變體的氨基酸序列如seq?id?no:2或seq?idno:3所示。

12、seq?id?no:2所示的氨基酸序列包括232個(gè)氨基酸殘基，突變位點(diǎn)按eu?numbering系統(tǒng)進(jìn)行，第223位、第228位的丙氨酸以及第230位依次如下序列中下劃線所示位置：

13、vdkkivpadcgcapcicavpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafpapiektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgl。

14、seq?id?no:3中第223位、第228位的丙氨酸、第230位、第330位、第332位依次如下序列中下劃線所示位置：

15、vdkkivpadcgcapcicavpevssvfifppkpkdvltitltpkvtcvvvdiskddpevqfswfvddvevhtaqtqpreeqfnstfrsvselpimhqdwlngkefkcrvnsaafplpeektisktkgrpkapqvytipppkeqmakdkvsltcmitdffpeditvewqwngqpaenykntqpimdtdgsyfvysklnvqksnweagntftcsvlheglhnhhtekslshspgl。

16、非哺乳動物糖基化區(qū)別于哺乳動物糖基化在于是否含有唾液酸修飾以及甘露糖的含量。在本技術(shù)提供的技術(shù)方案中，糖基化主要為n-糖基化，糖基來源于甘露糖、n-乙酰葡萄糖胺和巖藻糖中的至少一種；糖基連接形成的糖鏈結(jié)構(gòu)選自高甘露糖型、寡甘露糖型、巖藻糖型中的一種或多種，高甘露糖型由glcnac和甘露糖組成，且含有5～9個(gè)甘露糖；寡甘露糖是指小于5個(gè)甘露糖；巖藻糖型是指含有巖藻糖。本技術(shù)提供的方案中，上述糖基化位點(diǎn)均位于fc變體的第297位的氨基酸上。非哺乳動物糖基化有助于提高融合蛋白與dc細(xì)胞的結(jié)合和dc活化。

17、進(jìn)一步地，所述非哺乳動物為昆蟲。進(jìn)一步地，所述非哺乳動物為草地貪夜蛾。更進(jìn)一步地，上述融合蛋白是在sf9昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)得到的。

18、在本技術(shù)提供的方案中，前列腺癌腫瘤抗原是指前列腺癌細(xì)胞上存在于正常組織細(xì)胞不同的抗原成分，可以通過抗原誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗前列腺癌免疫應(yīng)答。進(jìn)一步地，所述前列腺癌腫瘤抗原為前列腺酸性磷酸酶(pap)，pap是一種前列腺外分泌物中能水解磷酸酯的糖蛋白，選擇其作為抗原多肽，可以有效產(chǎn)生免疫應(yīng)答，以增強(qiáng)人體對前列腺癌的免疫效果。具體地，前列腺酸性磷酸酶(pap)的氨基酸序列如seq?id?no:4所示序列中的第1-354位。

19、在本技術(shù)提供的方案中，上述融合蛋白主要包括能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的前列腺癌腫瘤抗原和與dc細(xì)胞結(jié)合的鼠源fc變體，鼠源fc變體可連接在多肽抗原的c末端，或者，也可以通過連接肽將多肽抗原和鼠源fc變體連接。在一種具體實(shí)施方式中，連接肽的氨基酸序列為gggs、srgggs中的至少一種。

20、在本技術(shù)提供的方案中，上述融合蛋白還可以包括蛋白標(biāo)簽，以便于目的基因的表達(dá)、檢測和純化。進(jìn)一步地，所述蛋白標(biāo)簽可以為his標(biāo)簽，所述his標(biāo)簽連接在所述多肽抗原的n末端，以提高融合蛋白的純化效率。

21、如上所述的融合蛋白是一種經(jīng)過糖基化后的融合蛋白，包括能夠引起人體免疫反應(yīng)的前列腺癌腫瘤抗原和鼠源fc變體，上述融合蛋白可通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)后得到。

22、本技術(shù)第二方面提供一種編碼上述任一所述融合蛋白的核酸分子。

23、本技術(shù)第三方面提供一種重組表達(dá)載體，包括上述核酸分子。

24、本技術(shù)第四方面提供一種宿主細(xì)胞，包括上述重組表達(dá)載體。

25、本技術(shù)第五方面提供一種藥物組合物，包括上述任一所述的融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體。

26、本技術(shù)中，藥學(xué)上可接受的載體在其使用的劑量和濃度上對細(xì)胞或個(gè)體是無毒的。通常生理上可接受的載體是ph緩沖溶液。本技術(shù)提供的藥物組合物進(jìn)一步為注射劑，上述載體中也可以包括水、乙醇、聚乙二醇等稀釋劑以及氯化鈉、葡萄糖或甘油等等滲添加劑。此外，還可以添加常規(guī)的助溶劑、緩沖劑等。

27、本技術(shù)第六方面提供上述任一所述的融合蛋白在制備用于治療前列腺癌的藥物方面的應(yīng)用。

28、本技術(shù)第七方面提供上述任一所述的融合蛋白在制備用于治療表達(dá)pap腫瘤抗原的任一腫瘤的藥物方面的應(yīng)用。

29、在一種具體實(shí)施方式中，治療的腫瘤包括表達(dá)pap腫瘤抗原的任一腫瘤。

30、癌癥的治療效果表現(xiàn)為抑制受試者中腫瘤細(xì)胞生長和/或限制其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。

31、本技術(shù)第八方面提供一種治療前列腺癌的方法，將上述融合蛋白施用給受試者。

32、本技術(shù)提供的融合蛋白是由鼠源fc變體和前列腺癌腫瘤抗原融合而成，鼠源fc變體有助于提高與dc細(xì)胞的結(jié)合和dc活化，刺激人體發(fā)生免疫應(yīng)答，將其與腫瘤抗原融合形成的融合蛋白可作為疫苗使用，可激活人體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而起到治療腫瘤的作用。