本發(fā)明涉及一種靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針及其合成方法和應用，屬于熒光分子探針。

背景技術(shù)：

1、μ阿片受體(μopioid?receptor，mor)，屬于g蛋白偶聯(lián)受體(gpcrs)a家族，主要通過抑制腺苷酸環(huán)化酶的異源三聚體g蛋白(gi/o)來實現(xiàn)其生理作用，主要分布腦干、脊髓和大腦皮層以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多區(qū)域。μ阿片受體可以與特定的拮抗劑和激動劑結(jié)合而產(chǎn)生特定的阿片效應如鎮(zhèn)痛效應、獎賞系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、呼吸抑制、消化系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等。mor與特定的內(nèi)源性或者外源性的小分子(丁丙諾啡等)或者短肽(腦啡肽等)結(jié)合從而激活下游gi/o信號通路產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，早期開發(fā)的小分子mor配體大多在激活gi/o介導的鎮(zhèn)痛作用通路同時也激活了具有呼吸抑制、成癮性以及藥物耐受等副作用的β-arresting(β-阻遏素招募蛋白)通路，嚴重限制了作用于mor受體的藥物開發(fā)。近年來為了減少鎮(zhèn)痛藥物的不良反應，開發(fā)作用于gi/o通路而不激活β-arresting通路的mor偏向性配體成為了開發(fā)新型鎮(zhèn)痛藥的重要研究方向。

2、在mor偏向性配體的研究過程中，小分子熒光配體發(fā)揮了重要作用。這是一類可以通過激發(fā)光激發(fā)而發(fā)出特定波長熒光信號并且具有特定靶向物的小分子化合物，由發(fā)射熒光信號作用的熒光基團、具有靶點識別作用的靶向基團以及連接二者的連接鏈組成。熒光配體的設(shè)計中需要考慮最終探針的理化性質(zhì)和藥理活性，以確保熒光共軛物對受體的親和力和選擇性不會顯著降低。通過合理地將mor激動劑或拮抗劑與各種熒光團共軛，可以設(shè)計出能特異性識別mor的熒光配體。這一類熒光配體在未與靶點結(jié)合時表現(xiàn)出較低的熒光信號且一般要求具有較高的穩(wěn)定性和生物相容性。這些優(yōu)勢使得它們可以用于實時監(jiān)測活細胞或體內(nèi)配體與靶點受體之間的相互作用以展示靶點受體藥理學、生理學、動力學的相關(guān)信息。這類高特異性高靈敏度并具有熒光開啟特性的熒光配體可以在活細胞或體內(nèi)可視化定位受體甚至監(jiān)測復雜的體內(nèi)生物過程，廣泛應用于生物傳感與檢測、藥物篩選與藥效評價等領(lǐng)域。

3、斑馬魚作為新型模式生物，具有胚胎時期透明和體型小等獨特的成像優(yōu)勢。因此，具有強組織穿透力的特異性熒光配體可以用于斑馬魚體內(nèi)生物分子的可視化分析，在減少生物樣品的損傷的同時可以最大限度地提高信噪比。此外，斑馬魚與人類具有高度的遺傳同源性，神經(jīng)系統(tǒng)與哺乳動物高度相似，具有相對應的腦區(qū)如嗅球、端腦、視頂蓋、間腦、中腦、延腦、下丘腦等，且多種神經(jīng)遞質(zhì)如谷氨酸、γ-氨基丁酸、乙酰膽堿、多巴胺、5-羥色胺等均在斑馬魚大腦得到表征。斑馬魚編碼的μ-阿片受體(zfor2)具有七個潛在的跨膜結(jié)構(gòu)域，其基因序列也顯示出與人類受體的高度的同一性。斑馬魚作為易于操作的模型生物結(jié)合高分辨率的體內(nèi)成像技術(shù)，使斑馬魚可以作為熒光配體活體成像的理想選擇，以實現(xiàn)生物分子可視化的在體成像。

4、商業(yè)化的熒光團有熒光素、羅丹明、香豆素、bodipy、alexa?fluor系列染料、cy系列(全花菁)染料等。然而這些染料的一些化學性質(zhì)限制了其發(fā)展，例如水溶性差、發(fā)射波長與生物組織自身熒光相重疊造成信號干擾、穩(wěn)定性較差、由于熒光基團的加入使得活性基團與靶點得結(jié)合能力下降、分子量大而導致成藥性差等，比如專利(202210961498.2)公開的熒光探針最大發(fā)射波長為480nm，且在該波長下的熒光信號受到生物自身熒光的干擾產(chǎn)生假陽性信號，不利于進行活體成像。另外目前的大多數(shù)mor熒光配體都不具備點亮機制因此只能起到簡單的標記功能，在標記完成后需要對環(huán)境中以及非特異性結(jié)合的熒光配體進行洗滌。此外，目前很少有將此類熒光配體應用于斑馬魚活體成像以解釋相應靶點生物分子的相關(guān)信息。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供了一種不受生物自身熒光影響的靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針及其合成方法和應用。

2、技術(shù)方案：為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針或其藥學上可接受的鹽，該探針的結(jié)構(gòu)式如下式所示：

3、

4、其中，n＝3、4、5、6、7。

5、優(yōu)選地，該探針的結(jié)構(gòu)式如下式所示：

6、

7、本發(fā)明還提供了一種制備所述靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針的方法，包括以下步驟：

8、(1)以納曲酮作為原料通過還原反應合成具有鏈接位點的外消旋中間體1；

9、(2)2,4,6-三甲基吡喃四氟硼酸鹽、4-(二甲基氨基)肉桂醛作為原料合成4-((1e,3e)-4-(4-(二甲基氨基)苯基)丁-1,3-二烯-1-基)-2,6-二甲基吡啶鎓2，通過親核取代反應合成吡啶熒光團3；

10、(3)具有連接位點的中間體1與具有連接鏈的吡啶熒光團3通過羧基與氨基縮合反應生成終產(chǎn)物(i)。

11、其中，合成步驟(1)具體包括：

12、

13、合成步驟(2)具體包括：

14、

15、合成步驟(3)具體包括：

16、

17、本發(fā)明所述的熒光配體基于分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機理(ict)通過合理的合成路線將特異性靶向mor的藥效基團納曲酮與具有良好熒光性質(zhì)的吡啶熒光團結(jié)合，構(gòu)建出一種具有環(huán)境響應性熒光開啟機制的特異性靶向mor的小分子近紅外熒光配體。根據(jù)該探針的性質(zhì)以其為工具分子進行mor的可視化研究。

18、本發(fā)明還提供了所述靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針在聚集誘導發(fā)光材料方面的應用。

19、本發(fā)明還提供了所述靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針在制備檢測/診斷與μ阿片受體介導的相關(guān)疾病的試劑或藥物方面的應用。

20、本發(fā)明還提供了所述靶向mor的響應性吡啶類近紅外熒光探針在制備篩選μ阿片受體相關(guān)疾病的藥物中的應用。

21、其中，所述藥物為μ阿片受體激動劑或拮抗劑。

22、其中，mor的濃度為0.81-104.00μg/ml。

23、因此，基于之前開發(fā)的各種小分子熒光配體的缺陷，對吡啶類染料進行結(jié)構(gòu)修飾從而開發(fā)出水溶性好，穩(wěn)定性強，成藥性好，且具有高特異性高靈敏度的開啟特性的熒光配體一直是醫(yī)學診斷試劑研究領(lǐng)域的重要方向。

24、合成熒光配體被廣泛用于生物分子相關(guān)的體內(nèi)定位監(jiān)測和可視化。本發(fā)明的目的在于提供了一種具有靶向mor的響應性小分子近紅外熒光配體的合成方法及其在活細胞與斑馬魚中的應用。

25、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點：1、本發(fā)明所述熒光探針對于mor與各類配體的結(jié)合動力學研究具有重要作用，有助于解釋相關(guān)的化合物的活性作用機制，同時為相關(guān)疾病的研究提供先導化合物，對于檢測μ阿片受體診斷試劑的研究領(lǐng)域具有廣闊的應用前景；2、本發(fā)明開發(fā)的吡啶類小分子熒光配體(ⅰ)分子量小、毒性低、斯托克斯位移大、摩爾消光系數(shù)大、合成步驟簡單，成本低廉，對比起之前的大多數(shù)熒光配體，利用藥效團特有的化學性質(zhì)，通過簡單的質(zhì)子化步驟，在不改變配體化學結(jié)構(gòu)的情況下提高了吡啶熒光團水溶性；3、所述熒光配體激發(fā)發(fā)射波長位于近紅外區(qū)，不易受到生物自身熒光的干擾，具有較高的信噪比，能特異性的識別mor，與mor疏水區(qū)域結(jié)合后產(chǎn)生可觀的熒光信號，避免了洗滌操作，可以對mor進行高靈敏度檢測；4、引入了簡單且穩(wěn)定的熒光團結(jié)構(gòu)，其由于簡單的共軛結(jié)構(gòu)其電子給體部分和受體相對穩(wěn)定，且熒光團的體積較小，故提高了熒光配體(ⅰ)的穩(wěn)定性，降低了對受體結(jié)合力的影響，靶向活性不易被破壞，體內(nèi)外實驗結(jié)果表明了此系列探針在體內(nèi)外具有優(yōu)異的穩(wěn)定性以及靶向性，適合用于在共聚焦顯微鏡下對活細胞細胞膜上的mor進行實時監(jiān)測；5、通過斑馬魚腦部注射實驗，證明了該配體可以定位斑馬魚腦部的mor受體，對確定活體中mor的具體分布及相關(guān)的動態(tài)信息研究具有重要價值。