本發(fā)明涉及定量長(zhǎng)棘海星環(huán)境dna，尤其涉及一種現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確定量長(zhǎng)棘海星環(huán)境dna的方法。

背景技術(shù)：

1、“珊瑚殺手”長(zhǎng)棘海星(acanthaster?cf.solaris,crown-of-thorns?starfish，cots)的暴發(fā)會(huì)造成大面積的珊瑚死亡，從而影響珊瑚群落的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步導(dǎo)致海洋漁業(yè)資源減少和生物多樣性降低，甚至破壞珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。為了減輕暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)施有效的預(yù)防性管理策略具有重要意義。然而，由于長(zhǎng)棘海星的幼體和成體能見度低、行為隱蔽，依靠蝠鲼拖網(wǎng)等常規(guī)生態(tài)調(diào)查方法只能發(fā)現(xiàn)5-10％的長(zhǎng)棘海星。為此，開發(fā)實(shí)用的監(jiān)測(cè)工具或方法對(duì)長(zhǎng)棘海星密度進(jìn)行有效的現(xiàn)場(chǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)具有重要的意義。

2、環(huán)境dna(environmental?dna，edna)技術(shù)的出現(xiàn)為長(zhǎng)棘海星的有效監(jiān)測(cè)提供了新的思路和技術(shù)方案。edna定義為通過糞便、身體粘液、血液和脫落的組織或鱗片從大型生物體中脫落并懸浮在水和沉積物等環(huán)境樣本中的體外遺傳物質(zhì)。edna分析在過去十年中迅速普及，主要是因?yàn)榕c傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法相比，環(huán)境樣本中包含的dna信號(hào)的復(fù)雜性有助于檢測(cè)廣泛的分類群和更多的個(gè)體物種，因此edna分析可以進(jìn)行大規(guī)模的生物多樣性評(píng)估和生態(tài)系統(tǒng)評(píng)估，具有更低的成本和更高的時(shí)間效率、特異性和敏感性且其樣品的采集方法是通用的、易于實(shí)現(xiàn)的無創(chuàng)環(huán)境采樣方法。當(dāng)前，絕大多數(shù)edna檢測(cè)方法都是基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、熒光定量pcr(qpcr)、微滴式數(shù)據(jù)pcr(ddpcr)等分子技術(shù)進(jìn)行識(shí)別跟定量。然而，在水生環(huán)境中，edna的檢測(cè)受到起源、運(yùn)輸過程、衰減和當(dāng)?shù)氐膭?dòng)力擴(kuò)散條件的影響，如年齡、食物來源、水溫、群落結(jié)構(gòu)等，這些物理及生物變量會(huì)導(dǎo)致組織脫落體積和速率發(fā)生顯著變化。此外，從廣闊的海洋環(huán)境中有效的捕獲edna其中還涉及巨大體量的水體和動(dòng)態(tài)海洋物理性質(zhì)(洋流、垂直混合運(yùn)動(dòng)、潮汐)，因此，edna在大洋中的檢測(cè)具有更大的挑戰(zhàn)。盡管目前對(duì)edna的檢測(cè)的技術(shù)具有良好的可靠性，但開發(fā)可靠靈敏的、能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)長(zhǎng)棘海星edna進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)有效監(jiān)測(cè)的分析工具具有更重要的意義。

3、電化學(xué)生物傳感器因其具有可靠性、易于小型化、成本低、效益高被認(rèn)為是即時(shí)檢測(cè)edna的理想工具。目前已有研究人員成功構(gòu)建了基于線性探針的電化學(xué)生物傳感器，首次應(yīng)用于長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)。但是該工作一維的線性探針結(jié)構(gòu)由于未結(jié)合探針的存在容易受到強(qiáng)烈的背景信號(hào)影響，容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)。此外，一維探針結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的空間擁擠效應(yīng)導(dǎo)致所構(gòu)建傳感器靈敏度低、特異性。因此，開發(fā)新穎dna探針納米結(jié)構(gòu)，有助于制備高效電化學(xué)生物傳感器，對(duì)長(zhǎng)棘海星edna進(jìn)行可靠靈敏的現(xiàn)場(chǎng)有效監(jiān)測(cè)。

4、目前已有研究人員成功構(gòu)建了基于線性探針的電化學(xué)生物傳感器，首次應(yīng)用于長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)。但是該工作所采用的一維的線性探針結(jié)構(gòu)，由于未結(jié)合探針的存在，容易受到強(qiáng)烈的背景信號(hào)影響產(chǎn)生假陽性信號(hào)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確定量長(zhǎng)棘海星環(huán)境dna的方法，解決現(xiàn)有一維線性dna探針結(jié)構(gòu)易產(chǎn)生假陽性信號(hào)及空間擁擠效應(yīng)所導(dǎo)致的生物傳感器靈敏度低、特異性差的技術(shù)問題。

2、開發(fā)了一種基于三嵌段polya-dna捕獲探針的電化學(xué)生物傳感器，旨在提升長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性。特殊的捕獲探針結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，顯著改善了生物傳感器的檢測(cè)效率、特異性、穩(wěn)定性和再生性。更重要的是，經(jīng)海上測(cè)試驗(yàn)證，該傳感器對(duì)南海長(zhǎng)棘海星暴發(fā)站位的檢測(cè)表現(xiàn)出優(yōu)異的準(zhǔn)確性。這一技術(shù)創(chuàng)新為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)長(zhǎng)棘海星暴發(fā)前階段的密度提供了新的有效方法。

3、克服一維線性dna探針結(jié)構(gòu)容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)、空間擁擠效應(yīng)等導(dǎo)致的靈敏度低、特異性差的難題。開發(fā)了基于三嵌段polya-dna捕獲探針構(gòu)建出高效的電化學(xué)生物傳感器，用于改善長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)的靈敏性、可靠性。特殊的捕獲探針結(jié)構(gòu)提高了該生物傳感器的檢測(cè)效率，特異性，穩(wěn)定性和再生性。更重要的是，對(duì)南海長(zhǎng)棘海星暴發(fā)海域的海上測(cè)試結(jié)果證明該生物傳感器具有良好的可靠性。這項(xiàng)工作為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)長(zhǎng)棘海星暴發(fā)前階段的密度提供了一種新穎的技術(shù)。

4、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

5、一種現(xiàn)場(chǎng)準(zhǔn)確定量長(zhǎng)棘海星環(huán)境dna的方法，所述方法包括如下步驟：

6、步驟1：znse/nhc/au電極材料制備；

7、步驟2：長(zhǎng)棘海星特異性引物的設(shè)計(jì)；

8、步驟3：dna探針的設(shè)計(jì)；

9、步驟4：基于三嵌段polya-dna探針生物傳感器的構(gòu)建。

10、進(jìn)一步，步驟1的具體過程為：

11、步驟1.1：zif-8的合成，將5.95g硝酸鋅溶于150ml甲醇，將所得溶液倒入150ml含有6.16g?2-甲基咪唑的甲醇溶液中，常溫下攪拌24h，用甲醇洗滌并離心收集樣品，60℃烘干；

12、步驟1.2：znse/nhc的合成，將100mg?zif-8、250mg?se粉分別放置在兩個(gè)石英舟中，其中裝有硒粉的石英舟放在管式爐上游，在650℃升溫速率為5℃/min的惰性氣體下退火2h，冷卻至室溫后，收集znse/nhc粉末；

13、步驟1.3：znse/nhc/au的合成，將5mg的znse/nhc材料分散在10ml的水中，加入85μl?30mm的氯金酸攪拌30min，接著，往150ml水中加入32.5mg檸檬酸鈉、0.14mg的單寧酸及7mg的碳酸鉀，將兩種溶液混合均勻后，在70℃的水浴中攪拌10min，最后，用清水離心收集材料，并在60℃真空烘干。

14、進(jìn)一步，步驟2的具體過程為：

15、特異性引物的dna序列數(shù)據(jù)從genbank獲得，序列號(hào)為：nc_007788.1，引物的范圍對(duì)應(yīng)于長(zhǎng)度為390bp的長(zhǎng)棘海星序列的6584-7271bp，此外，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行長(zhǎng)棘海星基因組dna的pcr擴(kuò)增，pcr擴(kuò)增步驟如下：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s，持續(xù)35個(gè)循環(huán)，pcr完成后進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)，并使用凝膠電泳成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

16、進(jìn)一步，步驟3中：對(duì)特異性引物進(jìn)行基因測(cè)序，將獲得的序列在ncbi網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)想要設(shè)計(jì)的探針結(jié)構(gòu)，確定進(jìn)行比對(duì)的堿基數(shù)，根據(jù)堿基數(shù)對(duì)dna序列進(jìn)行細(xì)分，不斷重復(fù)比對(duì)，直到獲得設(shè)定結(jié)果，獲得結(jié)果的堿基就具有dna探針的潛力，然后通過http://www.unafold.org網(wǎng)站來對(duì)所設(shè)計(jì)的dna進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，最后使用無菌的te溶液制備所有寡核苷酸儲(chǔ)備液，-20℃保存，并在使用過程中根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。

17、進(jìn)一步，步驟3中，探針的引物1的序列為：tacaagacgcatcttccccc，探針的引物2的序列為：ccacttctagtaagcggggc，探針的pa30p-1的序列為：ggtttgttctggaggcacacacaca30cacacacacattgcccctctaaaaa，探針的sp-1的序列為：bio-tgattgttcatatggtttct，探針的target1的序列為：cctccagaacaaaccggttctttttagaggggcaaggactagaaaccatatgaacaatca。

18、進(jìn)一步，步驟4的具體過程為：

19、首先往打磨干凈的玻碳電極上滴加20μl?2mg/ml的znse/nhc/au的殼聚糖分散液，待自然風(fēng)干后，往電極表面加入20μl，0.5μm的pa30p-1dna探針溶液，在室溫下反應(yīng)8h，隨后加入10μl?1nm?6-巰基-1-己醇作為非特異性信號(hào)掩蔽劑，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為30min，隨后用無菌水沖洗干凈，制備好的電極保存至-4℃條件以便后續(xù)使用；

20、然后，將100nm生物素修飾的信號(hào)探針和固定濃度目標(biāo)dna混合成的溶液水浴加熱至95℃反應(yīng)10min，然后在冰水浴下快速冷卻20min，緊接著將該預(yù)混液20μl添加組裝好的電極上，室溫下孵育1.5h，經(jīng)過dna雜交反應(yīng)后，將10μl?1mg/μl的avidin-hrp滴加到電極表面孵育30min，最后用沖洗緩沖液洗滌干凈后，在tmb下進(jìn)行電化學(xué)測(cè)試，實(shí)驗(yàn)采用的是zahner電化學(xué)工作站和傳統(tǒng)的三電極體系，包括ag/agcl參比電極、pt對(duì)電極和gce工作電極，測(cè)試手段包括以下三種：電化學(xué)阻抗譜、循環(huán)伏安法和計(jì)時(shí)電流法進(jìn)行測(cè)量，電化學(xué)阻抗譜是在5mm的鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀以及0.1m氯化鉀為電解液，交流電壓為5mv，電壓頻率為0.1hz～100khz下進(jìn)行測(cè)量的，循環(huán)伏安法的掃描速度為50mv/s，電勢(shì)為0～0.5v，計(jì)時(shí)電流法的掃速是30mv/s，測(cè)試時(shí)長(zhǎng)為120s，待電流穩(wěn)定后記錄數(shù)值。

21、還包括電極材料表征、生物傳感器構(gòu)建驗(yàn)證和生物傳感器的性能測(cè)試等步驟。

22、本發(fā)明由于采用了上述技術(shù)方案，具有以下有益效果：

23、(1)本發(fā)明為了克服一維線性dna探針結(jié)構(gòu)容易產(chǎn)生假陽性信號(hào)、空間擁擠效應(yīng)等導(dǎo)致的靈敏度低、特異性差的難題。本發(fā)明，開發(fā)了基于三嵌段polya-dna捕獲探針構(gòu)建出高效的電化學(xué)生物傳感器，用于改善長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)的靈敏性、可靠性。特殊的捕獲探針結(jié)構(gòu)提高了該生物傳感器的檢測(cè)效率，特異性，穩(wěn)定性和再生性。更重要的是，對(duì)南海長(zhǎng)棘海星暴發(fā)站位的海上測(cè)試結(jié)果證明該生物傳感器具有良好的可靠性，為動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)長(zhǎng)棘海星暴發(fā)前階段的密度提供了一種新穎的技術(shù)。

24、(2)所構(gòu)建的電化學(xué)dna生物傳感器采用三嵌段polya-dna探針有序組裝策略，解決了傳統(tǒng)線性探針自組裝層狀態(tài)紊亂等問題，進(jìn)一步提高了電化學(xué)生物傳感器對(duì)長(zhǎng)棘海星edna檢測(cè)的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性和再生性。