本發(fā)明涉及獸用生物制品檢驗(yàn)，尤其涉及一種a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝檢測方法的建立及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（clostridium?perfringens），又稱魏氏梭菌，存在于很多健康動(dòng)物的腸道中，當(dāng)飼養(yǎng)和環(huán)境條件改變時(shí)，可引起畜禽的產(chǎn)氣莢膜梭菌病，一旦發(fā)病，會(huì)導(dǎo)致畜禽迅速死亡，病程極短，往往在未得到有效治療前便死亡。自產(chǎn)氣莢膜梭菌發(fā)現(xiàn)以來，在各個(gè)地區(qū)的畜禽中出現(xiàn)了一種病程短、發(fā)病急、死亡快、死亡率高的疾病（產(chǎn)氣莢膜梭菌?。以摬〉陌Y狀有時(shí)不明顯，往往在發(fā)病治療之前，畜禽便開始死亡，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。

2、因此對(duì)于該病主要以疫苗預(yù)防為主。目前，對(duì)于動(dòng)物免疫疫苗后效力檢測方法主要為血清中和法和免疫攻毒法。其中，血清中和法需要大量試驗(yàn)動(dòng)物且對(duì)操作者的技巧要求較高，需要潔凈級(jí)動(dòng)物試驗(yàn)房，不適用于牧場臨時(shí)檢驗(yàn)樣品。而免疫攻毒法需要靶動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，經(jīng)濟(jì)成本較高，且操作不方便。

3、間接血凝試驗(yàn)（iha）是血清學(xué)檢測中的經(jīng)典方法，經(jīng)過不斷改進(jìn)后，已廣泛用于檢測各種病原的血清抗體，與血清中和法相比，間接血凝試驗(yàn)操作過程簡便、節(jié)約時(shí)間和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、且成本低。

4、因此，如何建立一種可用于a型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗效力檢驗(yàn)的間接血凝試驗(yàn)方法成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、首先，本發(fā)明提供了一種抗原致敏紅細(xì)胞懸液的制備方法，包括：

2、用a型產(chǎn)氣莢膜梭菌制備外毒素溶液，制得免疫原；所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌的保藏編號(hào)為cgmcc?no.14880；

3、將紅細(xì)胞懸液與戊二醛混合后，醛化2~4h，以制得醛化紅細(xì)胞懸液；再將所述醛化紅細(xì)胞懸液進(jìn)行鞣酸化，制得醛化-鞣酸化的紅細(xì)胞懸液；

4、將所述免疫原與所述醛化-鞣酸化的紅細(xì)胞懸液混合，以制得抗原致敏紅細(xì)胞懸液。

5、本領(lǐng)域在制備致敏紅細(xì)胞時(shí)，通常采用的免疫原為純化后的蛋白，但是由于蛋白的純化方法復(fù)雜、純化條件苛刻，不易純化獲得符合致敏紅細(xì)胞要求的蛋白。而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，采用上述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌制備的外毒素溶液，可以直接作為免疫原致敏紅細(xì)胞，省去蛋白純化步驟。

6、進(jìn)一步，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，在采用上述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌的外毒素溶液作為免疫原致敏紅細(xì)胞時(shí)，需要在紅細(xì)胞醛化過程中控制醛化時(shí)間在2~4h，時(shí)間過長則間接血凝試驗(yàn)孔全部自凝，出現(xiàn)假陽性，時(shí)間過短則紅細(xì)胞破碎較多，醛化紅細(xì)胞保存時(shí)間縮短。

7、更優(yōu)選地，醛化時(shí)間為2.5~3h。

8、優(yōu)選地，醛化的溫度為4℃~25℃。

9、在一些實(shí)施方案中，將所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌接種厭氣肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基中，于36~37℃靜置培養(yǎng)4~5小時(shí)后收獲菌液，離心后用0.22μm濾膜過濾，將濾液用4~6kd中空纖維濃縮18~22倍，制得所述外毒素溶液（免疫原）。

10、在一些實(shí)施方案中，制得所述免疫原后，稀釋成不同滴度后注射小鼠，根據(jù)小鼠致死情況獲得小鼠最小致死量。

11、優(yōu)選地，所述免疫原的毒力為每毫升含620~630個(gè)小鼠最小致死量（mld）。

12、在一些實(shí)施方案中，所述紅細(xì)胞懸液中的紅細(xì)胞來源于綿羊血。

13、在一些實(shí)施方案中，醛化紅細(xì)胞懸液的濃度為4%~6%。

14、在一些實(shí)施方案中，醛化-鞣酸化的紅細(xì)胞懸液的濃度為4%~6%。

15、在一些實(shí)施方案中，所述抗原致敏紅細(xì)胞懸液的濃度為1.5%~2.5%。

16、在一些實(shí)施方案中，采用陽性血清、陰性血清測定抗原致敏單位，以最少量的抗原致敏紅細(xì)胞與相應(yīng)的陽性血清出現(xiàn)最高效價(jià)的凝集作為1個(gè)致敏單位，且抗原致敏紅細(xì)胞無自凝或者破裂現(xiàn)象。

17、在一些實(shí)施方案中，將含1~2個(gè)致敏單位的所述免疫原與4%~6%的醛化-鞣酸化紅細(xì)胞懸液混合，以制得抗原致敏紅細(xì)胞懸液。

18、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述任一方案所制得的抗原致敏紅細(xì)胞懸液。

19、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法的建立方法，包括：

20、使用不同外毒素含量的權(quán)利要求1所述的免疫原致敏所述醛化-鞣酸化的紅細(xì)胞懸液，測定同一a型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清的最高血清效價(jià)，確定最高血清效價(jià)所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度，并建立a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法。

21、在一些實(shí)施方案中，所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清的制備方法包括：

22、用a型產(chǎn)氣莢膜梭菌制備外毒素溶液，然后將所述外毒素溶液進(jìn)行滅活脫毒后制得a型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素溶液，而后將所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素溶液制備成a型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素滅活疫苗；再將所述滅活疫苗免疫動(dòng)物，分離血清，制得所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清。

23、優(yōu)選地，采用氫氧化鋁膠作為佐劑制備a型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素滅活疫苗。

24、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的抗原致敏紅細(xì)胞懸液、或所述的建立方法在血清中和抗體效價(jià)檢測中的應(yīng)用。

25、在一些實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括：

26、將所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素溶液制備成最高血清效價(jià)所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度的抗原溶液，致敏所述醛化-鞣酸化的紅細(xì)胞懸液，然后加入待測血清反應(yīng)，根據(jù)紅細(xì)胞凝集情況判斷血清中和抗體效價(jià)。

27、在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)的條件為在室溫條件下反應(yīng)45~60min；

28、或所述反應(yīng)的條件為在35~39℃條件下反應(yīng)30~45min。

29、在一些實(shí)施方案中，所述最高血清效價(jià)所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為140~160個(gè)小鼠最小致死量毒素/ml。

30、在一些實(shí)施方案中，間接血凝效價(jià)(nlog2)的計(jì)算方法為：

31、

32、進(jìn)一步，本發(fā)明提供了所述的抗原致敏紅細(xì)胞懸液、或所述的建立方法、或所述的應(yīng)用在a型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗效力檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

33、在一些實(shí)施方案中，通過定量確定間接血凝效價(jià)與血清中和抗體效價(jià)之間的相關(guān)性后，采用所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法對(duì)a型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的效力進(jìn)行檢驗(yàn)。

34、在一些實(shí)施方案中，中和抗體效價(jià)大于等于6的血清間接血凝抗體效價(jià)大于等于5。

35、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

36、本發(fā)明采用a型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素溶液作為免疫原，以a型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素抗原最小致死量為依據(jù)，通過篩選間接血凝試驗(yàn)中抗原最佳稀釋度，建立了一種敏感性、特異性和符合率好的a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法，采用該試驗(yàn)法檢測疫苗免疫動(dòng)物血清的間接血凝效價(jià)，能夠代替免疫攻毒法以及血清中和法應(yīng)用于a型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的效力檢驗(yàn)中。

37、本發(fā)明的方法特異性強(qiáng)，敏感性好，符合率高；而且操作簡單，不需要特殊設(shè)備，結(jié)果判斷直觀，肉眼可觀，能快速檢測，適合在基層工作中推廣。

技術(shù)特征：

1.一種抗原致敏紅細(xì)胞懸液的制備方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述抗原致敏紅細(xì)胞懸液的濃度為1.5%~2.5%。

3.一種抗原致敏紅細(xì)胞懸液，其特征在于，其由權(quán)利要求1或2所述的制備方法制得。

4.一種a型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法的建立方法，其特征在于，包括：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的建立方法，其特征在于，所述a型產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性血清的制備方法包括：

6.權(quán)利要求1或2所述的制備方法、或權(quán)利要求3所述的抗原致敏紅細(xì)胞懸液、或權(quán)利要求4或5所述的建立方法在血清中和抗體效價(jià)檢測中的應(yīng)用。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，包括：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述反應(yīng)的條件為在室溫條件下反應(yīng)45~60min；

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述最高血清效價(jià)所對(duì)應(yīng)的抗原稀釋度為140~160個(gè)小鼠最小致死量毒素/ml。

10.權(quán)利要求1或2所述的制備方法、或權(quán)利要求3所述的抗原致敏紅細(xì)胞懸液、或權(quán)利要求4或5所述的建立方法、或權(quán)利要求6~9中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用在a型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗效力檢驗(yàn)中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及獸用生物制品檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種A型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝檢測方法的建立及其應(yīng)用。本發(fā)明采用A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素溶液作為免疫原，以A型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素抗原最小致死量為依據(jù)，通過篩選間接血凝試驗(yàn)中抗原最佳稀釋度，建立了一種敏感性、特異性和符合率好的A型產(chǎn)氣莢膜梭菌間接血凝試驗(yàn)法，采用該試驗(yàn)法檢測疫苗免疫動(dòng)物血清的間接血凝效價(jià)，能夠代替免疫攻毒法以及血清中和法應(yīng)用于A型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗的效力檢驗(yàn)中。

技術(shù)研發(fā)人員：王婷,韓四娥,李化生,金鷹,郝穎,楊富貴,史文瑞,王巖,張娜,劉麗春
受保護(hù)的技術(shù)使用者：金宇保靈生物藥品有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9