本發(fā)明屬于基因編輯領(lǐng)域，更具體地，涉及多種sacas9核酸酶特異性的sgrna化學(xué)修飾方式以及靶向ttr基因序列。

背景技術(shù)：

1、crispr/cas9(clustered?regularly?interspaced?short?palindromicrepeats/crispr-associated?protein?9)核酸酶在多種物種、不同的細(xì)胞中以及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了有效的基因編輯。通過識(shí)別特定的pam序列及人工設(shè)計(jì)的sgrna(guide?rna,grna)，cas9特異性地結(jié)合在基因組上的不同位置，使dna形成雙鏈斷裂(double?strand?breaks,dsb)，通過激活內(nèi)源性的dna修復(fù)機(jī)制在缺口處產(chǎn)生插入、缺失從而達(dá)到基因敲除或敲入的目的。

2、cas9在細(xì)胞中的長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)可顯著增加其脫靶效率，以rna形式遞送實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)可顯著減少脫靶，提高安全性。

3、相比于廣泛使用的spcas9，sacas9體積更小而切割活性相當(dāng)，并且sacas9kkh變體的開發(fā)使sacas9的pam識(shí)別序列從“nngrrt”擴(kuò)展到“nnnrrt”，提高了sacas9的應(yīng)用靈活性。然而，sacas9及其sgrna基于修飾性rna形式的瞬時(shí)遞送方式在細(xì)胞內(nèi)的切割活性還未有研究。

4、采用陽離子脂質(zhì)納米顆粒將cas9的mrna及化學(xué)修飾性的sgrna遞送到細(xì)胞內(nèi)或動(dòng)物及人體內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)有效的基因敲除，達(dá)到基因治療的目的。經(jīng)過重度修飾的sgrna也比只在首尾修飾的sgrna更加穩(wěn)定，敲除效率更高。但是有些位置不適于過度修飾，否則會(huì)影響酶活性最終影響切割效率。因此，基于結(jié)構(gòu)學(xué)對(duì)sgrna進(jìn)行重度修飾是最佳策略，但是已有的sacas9的晶體結(jié)構(gòu)存在部分缺失，基于結(jié)構(gòu)學(xué)的sgrna修飾策略還有待研究。

5、家族性淀粉樣變性(attr)是編碼甲狀腺素運(yùn)載蛋白的基因ttr突變所致，其中ttr主要在肝臟中合成，在脈絡(luò)叢及視網(wǎng)膜中產(chǎn)生小部分，負(fù)責(zé)在整個(gè)身體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇及甲狀腺素。ttr通常在血液中作為可溶性四聚體蛋白循環(huán)。ttr突變導(dǎo)致錯(cuò)誤折疊和沉積，導(dǎo)致淀粉樣多神經(jīng)病變(fap)、家族性淀粉樣心肌病(fac)等。據(jù)估計(jì)，世界范圍內(nèi)約50000名患者可能受到fap及fac的影響。目前已研究一系列用于attr的治療方法，但無批準(zhǔn)的藥物可停止疾病進(jìn)展并改善生活質(zhì)量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種適用于sacas9核酸酶的可顯著提高編輯活性、降低脫靶效率的sgrna。

2、在第一方面，本發(fā)明提供了一種經(jīng)修飾的sacas9?sgrna，其包含20至22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的向?qū)na和77個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的sgrna骨架，并且所述sgrna的核苷酸序列包含至少一種化學(xué)修飾。

3、如本文所用，術(shù)語“sacas9”是指金黃色葡萄球菌cas9(staphylococcus?aureuscas9)。

4、如本文所用，術(shù)語“sgrna”是單鏈的向?qū)na分子，包括與靶dna互補(bǔ)的向?qū)na序列和sgrna骨架。

5、如本文所用，術(shù)語“sacas9?sgrna”(以下亦簡(jiǎn)稱為“sgrna”)是指適用于與sacas9核酸酶組合使用的sgrna。

6、如本文所用，術(shù)語“向?qū)na”是指能夠與靶dna互補(bǔ)的rna片段，位于sacas9?sgrna的5’末端。

7、如本文所用，術(shù)語“sgrna骨架”是crispr靶向識(shí)別系統(tǒng)中crispr?rna(crrna)的重復(fù)序列和反式激活crrna(tracrrna)的嵌合體，其中crrna除所述重復(fù)序列外還包含向?qū)na，可靶向不同的靶dna，而tracrrna是sgrna中的固定序列，包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可與cas9蛋白結(jié)合。

8、更具體地，本文中的sgrna骨架在5’至3’方向上依次包含重復(fù)序列/反向重復(fù)序列區(qū)、莖環(huán)1區(qū)、連接區(qū)、莖環(huán)2區(qū)和3’末端區(qū)，其中重復(fù)序列/反向重復(fù)序列區(qū)包括14nt重復(fù)序列(repeat)、4nt四環(huán)(tetraloop)和16nt反向重復(fù)序列(anti-repeat)，分別位于sgrna骨架5’端的1-14nt位置、15-18nt位置和19-34nt位置，重復(fù)序列與反向重復(fù)序列互補(bǔ)可形成莖環(huán)，與cas9結(jié)合；莖環(huán)1區(qū)(stem?loop1)共14nt，位于sgrna骨架5’端35-48nt位置；莖環(huán)2區(qū)(stem?loop2)共24nt，位于sgrna骨架5’端54-77nt位置；連接莖環(huán)1和莖環(huán)2的5nt連接區(qū)(linker)，位于sgrna骨架5’端49-53nt位置。進(jìn)一步地，本發(fā)明的sacas9?sgrna的3’末端為可變序列，更具體地，所述sacas9?sgrna還可任選地包含在3’末端的核苷酸序列uuuu。

9、根據(jù)上述對(duì)本發(fā)明的sacas9?sgrna結(jié)構(gòu)組成的描述，基于向?qū)na長(zhǎng)度(可以為20-22nt)的不同、以及是否在3’末端包含核苷酸序列uuuu，本發(fā)明的sacas9?sgrna的長(zhǎng)度可以在97-103nt之間(例如97nt、98nt、99nt、100nt、101nt、102nt或103nt)。

10、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種化學(xué)修飾可以選自2’-o-甲基修飾、2’-f修飾、2’-moe修飾和硫代磷酸鍵的修飾中的至少一種。

11、如本文所用，術(shù)語“化學(xué)修飾”是指核苷酸分子上的某個(gè)原子或基團(tuán)被另一個(gè)原子或基團(tuán)取代。

12、如本文所用，術(shù)語“2’-o-甲基修飾”是指核苷酸分子中的五碳糖的2號(hào)位碳上的羥基被-o-甲基(或稱為“甲氧基”、“-ome”等)取代。進(jìn)一步地，在本文中，術(shù)語“ma”、“mc”、“mu”、“mg”用于表示2’-o-甲基修飾的核苷酸。

13、如本文所用，術(shù)語“2’-f”是指核苷酸分子中的五碳糖的2號(hào)位碳上的羥基被f(或稱為“氟”、“氟原子”等)取代。進(jìn)一步地，在本文中，術(shù)語“fa”、“fc”、“fu”、“fg”用于表示2’-f修飾的核苷酸。

14、如本文所用，術(shù)語“2’-moe”是指核苷酸分子中的五碳糖的2號(hào)位碳上的羥基被moe基團(tuán)(或稱為“甲氧基乙基”、“-(ch2)2och3”等)取代。進(jìn)一步地，在本文中，術(shù)語“moea”、“moec”、“moeu”、“moeg”用于表示2’-o-moe修飾的核苷酸。

15、如本文所用，術(shù)語“硫代磷酸鍵的修飾(或稱為ps修飾)”是指連接核苷酸分子的磷酸二酯鍵中的“p＝o”被“p＝s”取代。進(jìn)一步地，在本文中，術(shù)語“a*”、“c*”、“u*”、“g*”用于表示3’端被硫代磷酸鍵修飾的核苷酸。當(dāng)核苷酸分子的中的五碳糖的2號(hào)位碳上的羥基和3’端的磷酸二酯鍵同時(shí)被修飾時(shí)，則使用兩種標(biāo)記的組合來表示該核苷酸，例如“ma*”、“mc*”、“mu*”、“mg*”、“fa*”、“fc*”、“fu*”、“fg*”等。

16、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的7個(gè)核苷酸中的至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)或至少4個(gè)核苷酸上。例如，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端的7個(gè)核苷酸中的1、2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸上，和/或存在于所述sacas9?sgrna的3’末端的7個(gè)核苷酸中的1、2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸上，其中兩個(gè)末端處的修飾數(shù)量和位置不受相互影響。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的至少3個(gè)或至少4個(gè)核苷酸上。

17、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第-14至-9、-3、-1、1、3至9、11至27、29至33、36至39、41、42、44至47、49至77位置的核苷酸中的至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)核苷酸上。

18、根據(jù)本發(fā)明，核苷酸位置的編號(hào)方式可參見圖2，以圖2的結(jié)構(gòu)為例，其中以sgrna骨架的5’端的第一個(gè)核苷酸作為起始向3’端依次編號(hào)為1、2、3…77、78、79、80、81；并且以向?qū)na的3’端的第一個(gè)核苷酸作為起始向5’端依次編號(hào)為-1、-2、-3、-4、-5…-18、-19、-20、-21。

19、在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第11-22和62-69位置的核苷酸中的至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第11-22位置的所有核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第62-69位置的所有核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9sgrna的第11-22和62-69位置的所有核苷酸上。

20、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的5’末端和/或3’末端各自的7個(gè)核苷酸中的至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)或至少5個(gè)核苷酸之間。例如，所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的5’末端的7個(gè)核苷酸中的2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸之間；和/或所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的3’末端的7個(gè)核苷酸中的2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸之間，其中兩個(gè)末端處的修飾數(shù)量和位置不受相互影響。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述硫代磷酸鍵的修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的至少4個(gè)或至少5個(gè)核苷酸之間。

21、在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明中的化學(xué)修飾為mod001-mod0013中的任一種。

22、在第二方面，本發(fā)明還提供了一種靶向ttr的sacas9?sgrna，其包含在5’末端的向?qū)na，所述向?qū)na的序列是如seq?id?no：1-9中任一種所示的核苷酸序列的至少20個(gè)、至少21個(gè)、或全部22個(gè)連續(xù)核苷酸。

23、如本文所用，術(shù)語“ttr”是指轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白(transthyretin)。

24、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述向?qū)na的序列可以是如seq?id?no：1-9中任一種所示的核苷酸序列的3’末端的至少20個(gè)、至少21個(gè)、或全部22個(gè)連續(xù)核苷酸。更優(yōu)選地，所述向?qū)na的序列可以是如seq?id?no：1-9中任一種所示的核苷酸序列的3’末端的21個(gè)連續(xù)核苷酸。為了更清楚地說明，以seq?id?no：1為例，seq?id?no：1所示的核苷酸序列的3’末端的21個(gè)連續(xù)核苷酸為gugucugaggcuggcccuacg。

25、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述sacas9?sgrna還可以包含77個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的sgrna骨架。

26、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述sacas9?sgrna的核苷酸序列可以包含至少一種化學(xué)修飾。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述至少一種化學(xué)修飾選自2’-o-甲基修飾、2’-f修飾、2’-moe修飾和硫代磷酸鍵的修飾中的至少一種。

27、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的7個(gè)核苷酸中的至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)或至少4個(gè)核苷酸上。例如，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端的7個(gè)核苷酸中的1、2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸上，和/或存在于所述sacas9?sgrna的3’末端的7個(gè)核苷酸中的1、2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸上，其中兩個(gè)末端處的修飾數(shù)量和位置不受相互影響。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的至少3個(gè)或至少4個(gè)核苷酸上。

28、在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第-14至-9、-3、-1、1、3至9、11至27、29至33、36至39、41、42、44至47、49至77位置的核苷酸中的至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)核苷酸上。

29、在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第11-22和62-69位置的核苷酸中的至少1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)或10個(gè)核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第11-22位置的所有核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的第62-69位置的所有核苷酸上。在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述2’-o-甲基修飾、2’-f修飾或2’-moe修飾可以存在于所述sacas9sgrna的第11-22和62-69位置的所有核苷酸上。

30、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的5’末端和/或3’末端各自的7個(gè)核苷酸中的至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)或至少5個(gè)核苷酸之間。例如，所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的5’末端的7個(gè)核苷酸中的2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸之間；和/或所述硫代磷酸鍵的修飾可存在于所述sacas9sgrna的3’末端的7個(gè)核苷酸中的2、3、4、5、6或全部7個(gè)核苷酸之間，其中兩個(gè)末端處的修飾數(shù)量和位置不受相互影響。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述硫代磷酸鍵的修飾可以存在于所述sacas9?sgrna的5’末端和/或3’末端各自的至少4個(gè)或至少5個(gè)核苷酸之間。

31、在本發(fā)明的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方式中，所述sacas9?sgrna的核苷酸序列如seq?idno：12-25和27-29中的任一種所示。

32、在第三方面，本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含上述的sacas9?sgrna，以及sacas9核酸酶或編碼sacas9核酸酶的mrna。

33、在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述組合物可以是例如藥物組合物。

34、在第四方面，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，其包含根據(jù)上述的sacas9?sgrna或上述的組合物，以及任選地使用說明書。

35、在第五方面，本發(fā)明還提供了上述的sacas9?sgrna、上述的組合物、或上述的試劑盒在修飾靶dna中的用途。