背景技術(shù)：

1、代謝病癥已逐漸成為威脅公共健康的問題，具有全世界約1/4的估計(jì)發(fā)病率。需要制定策略和治療措施來預(yù)防代謝病癥，特別是2型糖尿病(t2d)、肥胖和非酒精性脂肪性肝病(nafld)。

2、腸道微生物組生態(tài)失調(diào)已與這些代謝病癥相關(guān)，導(dǎo)致由于腸上皮通透性增加的炎癥狀態(tài)(taleb，frontiers?in?immunology，10：2113，2019)。腸上皮通過上皮細(xì)胞中的緊密連接和粘附連接的存在而得到維持，并且充當(dāng)針對(duì)外部物質(zhì)的保護(hù)屏障。然而，在炎癥性疾病中，這種屏障可以變得功能障礙，導(dǎo)致通透性增加和微生物組分例如脂多糖(lps)移動(dòng)到血液內(nèi)。這可以導(dǎo)致觀察到的炎癥，其牽涉代謝性心血管病的發(fā)展。

3、最近的證據(jù)已將吲哚-3-乙酸(iaa)(一種來自飲食色氨酸的腸道微生物群衍生的代謝物)與小鼠中針對(duì)肝損傷和皮脂腺病的抗性(ji等人，nutrient?11：2062，2019；li等人，frontiers?in?pharmacology，12：769501，2021)，以及小鼠(laurans等人，naturemedicine，24：1113，2018)和仔豬(liang等人，frontiers?in?microbiology，9：1736，2018)中改善的上皮屏障功能相聯(lián)系。在人中，已觀察到與健康受試者相比，在來自肥胖和t2d患者的糞便樣品中減少水平的色氨酸和iaa水平、以及增加水平的犬尿氨酸，以及類似地，患有肥胖和t2d的人中朝向更多犬尿氨酸和更少iaa的色氨酸代謝中的變化(laurans等人，2018，同上；natividad等人，cell?metabolism，28：737，2018)。

4、iaa和其它色氨酸衍生的化合物先前已被表征為芳烴受體(ahr)激動(dòng)劑，確定了腸道微生物組及其代謝物對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)的直接作用。體外數(shù)據(jù)證實(shí)了iaa誘導(dǎo)腸道免疫細(xì)胞中的芳烴受體(ahr)的激活，增加了抗炎白細(xì)胞介素如il-17和il-22的產(chǎn)生，所述白細(xì)胞介素對(duì)于抗微生物免疫和粘膜屏障完整性是重要的(laurans等人，2018，同上)。此外，iaa已顯示減弱由細(xì)胞因子和游離脂肪酸誘導(dǎo)的肝細(xì)胞中的脂肪生成(krishnan等人，cellreports，23：1099，2018)。

5、romasi&lee，j.microbiol.biotechnol.，23(12)，1726-1736，2013，doi：http：//dx.doi.org/10.4014/jmb.1308.08082公開了包含ipdc、aspc和iad1基因的產(chǎn)生iaa的大腸桿菌(e.coli)。

6、wo2017/123418(synlogic，inc)尤其公開了用于包括在細(xì)菌中以產(chǎn)生吲哚代謝物和衍生物的遺傳回路。

7、wo2021/242897(synlogic，inc)公開了用于產(chǎn)生iaa的基因盒，其可操作地連接到誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

8、仍然需要例如在腸道微生物組中有效的iaa原位生產(chǎn)，其在體內(nèi)具有有益效應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明人已有利地認(rèn)識(shí)到，可以通過修飾細(xì)菌以包括各種異源輸出蛋白來實(shí)現(xiàn)吲哚-3-乙酸(iaa)的分泌水平增加。如本領(lǐng)域已知的，通過細(xì)菌膜(革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌兩者)的分子擴(kuò)散可以限制擴(kuò)散到局部環(huán)境的特定分子的量。不受理論的束縛，一般而言，細(xì)菌膜是疏水性的，因此小分子越親水，它越不可能穿越膜。然而，對(duì)細(xì)胞有害的某些分子(例如毒素、細(xì)菌素等)更經(jīng)常連同提供特異性細(xì)胞外功能的某些分子(例如與群體感應(yīng)、鐵獲取等相關(guān)的分子)一起輸出。另外，一些分子通過專用輸出蛋白主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)通過膜(例如，過量的氨基酸可以從細(xì)胞中輸出以維持穩(wěn)態(tài)，例如在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的丙氨酸輸出蛋白alae和亮氨酸輸出蛋白leue兩者)，或輸出某一類別分子的輸出蛋白(例如，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的seta轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白輸出各種糖分子)。然而，迄今為止的大多數(shù)iaa轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白已在植物物種中發(fā)現(xiàn)。因此，在許多細(xì)菌中，iaa的分泌受到擴(kuò)散速率的限制。發(fā)明人已對(duì)細(xì)菌進(jìn)行改造，以表達(dá)能夠跨越細(xì)菌膜輸出iaa的異源輸出蛋白。出乎意料的是，異源輸出蛋白能夠在細(xì)菌膜內(nèi)形成并發(fā)揮功能。這導(dǎo)致iaa進(jìn)入局部環(huán)境內(nèi)的分泌增加，并且促成細(xì)菌內(nèi)的iaa表達(dá)的適應(yīng)性劣勢(shì)降低，因?yàn)?不受理論的束縛)iaa從細(xì)胞質(zhì)和/或周質(zhì)中移出到局部環(huán)境內(nèi)。

2、此外，仍然需要特別是用于治療應(yīng)用，來自細(xì)菌的一致且高水平的iaa生物合成。這通過本發(fā)明以幾種方式得以實(shí)現(xiàn)：

3、首先，在質(zhì)粒上包括用于iaa的生物合成的異源基因的先前嘗試已要求誘導(dǎo)型和/或弱啟動(dòng)子的控制。這已是必要的，因?yàn)楫?dāng)使用組成型啟動(dòng)子來控制質(zhì)粒上的iaa的異源基因表達(dá)時(shí)，它導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定性和異源基因內(nèi)高水平的遺傳突變。這些突變和不穩(wěn)定性最終導(dǎo)致基因失活，并且甚至可以導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞死亡。發(fā)明人出乎意料地認(rèn)識(shí)到，將異源基因直接提供到細(xì)菌的染色體內(nèi)導(dǎo)致異源基因的穩(wěn)定表達(dá)，而無相關(guān)的質(zhì)粒不穩(wěn)定性和有害的遺傳突變。

4、此外，發(fā)明人能夠使用組成型啟動(dòng)子來控制由細(xì)菌的染色體包含的異源基因的表達(dá)，其允許更高且更一致的iaa表達(dá)。出乎意料的是，與質(zhì)粒生產(chǎn)形成對(duì)比，如可以預(yù)料的，這種更高的生產(chǎn)似乎對(duì)細(xì)菌的適應(yīng)性幾乎沒有任何影響。

5、發(fā)明人還已選擇了特異性異源基因的組合用于iaa的生產(chǎn)和細(xì)胞外輸出(如圖2、5和7中所描述的)，其可能提供在以下一個(gè)或多個(gè)方面超過其它基因的優(yōu)點(diǎn)：用于體內(nèi)生產(chǎn)的生產(chǎn)穩(wěn)定性、生產(chǎn)水平、途徑效率和最佳溫度范圍。

6、因此，本發(fā)明提供以下：

7、在第一配置中：

8、提供了用于產(chǎn)生且分泌吲哚-3-乙酸(iaa)的修飾細(xì)菌或質(zhì)粒(例如接合質(zhì)粒)，其中所述細(xì)菌包含用于iaa的生物合成的一種或多種異源基因，并且其中：

9、a.該細(xì)菌進(jìn)一步包含編碼能夠?qū)aa輸出到細(xì)菌外的輸出蛋白的異源基因；或

10、b.該質(zhì)粒進(jìn)一步包含編碼能夠?qū)aa輸出到細(xì)菌外的輸出蛋白的異源基因，所述細(xì)菌包含所述質(zhì)粒并且產(chǎn)生且分泌iaa。

11、在第二配置中：

12、提供了用于吲哚-3-乙酸(iaa)的生物合成的修飾細(xì)菌或質(zhì)粒(例如接合質(zhì)粒)，其包含用于iaa的生物合成的異源基因，所述異源基因編碼：

13、i.來自泛菌屬(pantoea)物種，例如成團(tuán)泛菌(pantoea?agglomerans)的吲哚-3-丙酮酸脫羧酶(ipdc)；

14、ii來自擬南芥屬(arabidopsis)物種，例如擬南芥(arabidopsisthaliana)的色氨酸-丙酮酸氨基轉(zhuǎn)移酶1(taa1)；和

15、iii.來自黑粉菌屬(ustilago)物種，例如玉米黑粉菌(ustilago?maydis)的吲哚-3-乙醛脫氫酶(iad1)；

16、其中異源基因(i)至(iii)各自或全部處于一種或多種組成型啟動(dòng)子的控制下。

17、在第三配置中：

18、提供了包含如本文所述的質(zhì)粒(例如接合質(zhì)粒)的宿主(例如供體)細(xì)胞。

19、在第四配置中：

20、提供了藥物組合物，其包含如本文所述的修飾細(xì)菌，或包括包含如本文所述的質(zhì)粒(例如接合質(zhì)粒)的宿主(供體)細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑或載體

21、在第五配置中：

22、提供了在受試者的腸道中產(chǎn)生iaa的方法，其包括向所述受試者施用如本文所述的修飾細(xì)菌、如本文所述的宿主(供體)細(xì)胞或如本文所述的藥物組合物。

23、在第六配置中：

24、提供了治療代謝疾病例如心血管代謝疾病的方法，其包括向有此需要的受試者施用如本文所述的修飾細(xì)菌、如本文所述的宿主(供體)細(xì)胞或如本文所述的藥物組合物。

25、在第七配置中：

26、提供了如本文所述的修飾細(xì)菌、如本文所述的宿主(供體)細(xì)胞或如本文所述的藥物組合物，其用作藥劑。

27、在第八配置中：

28、提供了生產(chǎn)如本文所述的修飾細(xì)菌的方法，其中所述異源基因由所述細(xì)菌的染色體包含，所述方法包括使用重組改造(recombineering)以將異源基因引入細(xì)菌的染色體內(nèi)。