本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程，具體涉及到干細(xì)胞，干細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控，干細(xì)胞組織工程等技術(shù)，尤其是一種促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法。

背景技術(shù)：

1、心血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，特別是缺血性心血管疾病，如冠心病和腦卒中等，它們通過影響血氧供應(yīng)和組織愈合，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。在細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，輸注血管內(nèi)皮細(xì)胞(vec)或植入人工心血管組織已被證明可以顯著改善缺血區(qū)域的血液供應(yīng)，為治療這些疾病提供了新的希望。然而，當(dāng)前面臨的主要挑戰(zhàn)之一是功能性vec的數(shù)量嚴(yán)重不足，迫切需要一種安全、穩(wěn)定且高效的vec獲取方法。

2、傳統(tǒng)的vec獲取方法主要分為兩類：自體vec的分離和擴(kuò)增，以及干細(xì)胞的定向分化。自體vec的方法受限于樣本量有限、侵入性操作和功能退化等問題，難以滿足臨床需求。而干細(xì)胞分化方法雖然具有自我更新和多向分化的潛力，但目前分化體系存在效率低、時(shí)間長、毒副作用大等缺陷，限制了其臨床應(yīng)用。此外，胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞雖然具有強(qiáng)大的擴(kuò)增和分化能力，但存在倫理爭議、致瘤風(fēng)險(xiǎn)和基因安全性問題，限制了它們的廣泛應(yīng)用。

3、成體干細(xì)胞(asc)因其低免疫原性和倫理風(fēng)險(xiǎn)小而被視為有潛力的干細(xì)胞資源，但它們的體內(nèi)含量低，獲取過程侵入性，且存在分離提純效率低的問題。近年來，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hamsc)因其獨(dú)特的優(yōu)勢而受到關(guān)注，它們來源于胎盤，具有多能性、無免疫排斥反應(yīng)、低致瘤性，且易于獲取和擴(kuò)增。研究表明，hamsc能夠在體內(nèi)外分化為vec，并在人工血管模型中表現(xiàn)出促進(jìn)血管再生和抗血栓的特性。

4、盡管hamsc展現(xiàn)出作為vec來源的巨大潛力，但傳統(tǒng)的干細(xì)胞向vec分化的誘導(dǎo)體系主要依賴血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular?endothelial?growth?factor,vegf)等生物大分子。但這些大分子活性物質(zhì)介入紛繁的細(xì)胞生理和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，具有多重調(diào)控能力，其分化誘導(dǎo)效果較低，亟待提高。因此，開發(fā)一種新的分化體系，以提高h(yuǎn)amsc向vec分化的效率和功能，同時(shí)減少潛在的毒副作用，對于推動(dòng)干細(xì)胞治療心血管疾病的臨床應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法，該方法通過優(yōu)化分化體系，提高分化效率，減少分化過程中的潛在風(fēng)險(xiǎn)，以期達(dá)到更安全、更有效的心血管疾病治療目的。

2、本發(fā)明的一種促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的方法，包括以下步驟：制備靜電紡絲薄膜作為細(xì)胞培養(yǎng)基底；在靜電紡絲薄膜上種植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞hamsc；向培養(yǎng)基中加入血管內(nèi)皮生長因子vegf以誘導(dǎo)hamsc分化；維持細(xì)胞培養(yǎng)至血管內(nèi)皮細(xì)胞特征表達(dá)。

3、本發(fā)明的方法利用了靜電紡絲技術(shù)制備的薄膜作為細(xì)胞培養(yǎng)基底，該薄膜能夠提供類似細(xì)胞外基質(zhì)的微環(huán)境，從而有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化。通過在培養(yǎng)基中加入vegf，能夠特異性地誘導(dǎo)hamsc向血管內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，最終實(shí)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞特征的表達(dá)。本發(fā)明的方法不僅提高了分化效率，而且為組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供了一種新的細(xì)胞來源，有助于解決現(xiàn)有技術(shù)中血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量不足的問題。

4、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述靜電紡絲薄膜由聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物plcl制備而成。通過使用聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(plcl)作為靜電紡絲薄膜的材料，為hamsc提供了一種生物相容性好、可降解的細(xì)胞培養(yǎng)基底。plcl作為一種生物可降解材料，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)過程中逐漸降解，從而減少對細(xì)胞的長期異物刺激。此外，plcl的降解產(chǎn)物是乳酸和己內(nèi)酯，這些物質(zhì)在體內(nèi)可以自然代謝，降低了對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的潛在影響。使用plcl薄膜作為細(xì)胞培養(yǎng)基底，有助于維持細(xì)胞的正常生理狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的長期穩(wěn)定分化。

5、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述靜電紡絲薄膜的制備至少包括以下步驟：將plcl顆粒溶解于溶劑中形成紡絲液；利用靜電紡絲技術(shù)制備薄膜；對薄膜進(jìn)行后續(xù)處理，包括冷凍干燥、紫外線滅菌和明膠孵育。本發(fā)明通過一系列精細(xì)的靜電紡絲薄膜制備步驟，確保了薄膜的質(zhì)量和性能，從而為hamsc的培養(yǎng)和分化提供了一個(gè)優(yōu)良的平臺。首先，將plcl顆粒溶解于溶劑中形成紡絲液，利用靜電紡絲技術(shù)可以制備出具有特定微米或納米級纖維結(jié)構(gòu)的薄膜，這種結(jié)構(gòu)模仿了天然細(xì)胞外基質(zhì)的形態(tài)，有利于細(xì)胞的黏附和生長。其次，對薄膜進(jìn)行冷凍干燥和紫外線滅菌處理，既保證了薄膜的孔隙結(jié)構(gòu)，又確保了其無菌性，適合細(xì)胞培養(yǎng)。最后，通過明膠孵育處理，進(jìn)一步增強(qiáng)了薄膜的細(xì)胞黏附性，為hamsc的種植和分化創(chuàng)造了有利條件。這些技術(shù)步驟的綜合應(yīng)用，顯著提高了靜電紡絲薄膜作為細(xì)胞培養(yǎng)基底的性能，為hamsc的高效分化提供了重要保障。

6、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述vegf的濃度為50ng/ml。vegf的濃度精確至50ng/ml，不僅確保了分化過程中所需的有效濃度，而且有助于維持細(xì)胞培養(yǎng)的成本效益。此濃度的選擇可能基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，顯示在此水平下，hamsc的分化效率最高，同時(shí)避免了因濃度過高而可能引起的細(xì)胞過度增殖或功能異常。

7、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述細(xì)胞培養(yǎng)過程中每2天更換一次含有vegf的培養(yǎng)基，持續(xù)時(shí)間為14天。通過每2天更換一次含有vegf的培養(yǎng)基，并持續(xù)14天，確保了分化過程中vegf的持續(xù)存在和作用。這種周期性的更換機(jī)制不僅保證了培養(yǎng)環(huán)境中營養(yǎng)成分的更新，還有助于去除可能積累的代謝廢物或抑制因子，從而為細(xì)胞提供了一個(gè)穩(wěn)定和優(yōu)化的微環(huán)境。此外，14天的持續(xù)培養(yǎng)時(shí)間可能是基于實(shí)驗(yàn)觀察，認(rèn)為這一時(shí)間段足以實(shí)現(xiàn)hamsc到血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效分化。

8、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，還包括通過免疫熒光染色和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)qrt-pcr來檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物cd31的表達(dá)。通過免疫熒光染色和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物cd31的表達(dá)，可以直觀地觀察到細(xì)胞形態(tài)的變化和基因表達(dá)水平的定量分析。這種方法的應(yīng)用不僅有助于監(jiān)測和驗(yàn)證分化過程的成功，還可以通過分析cd31的表達(dá)模式來進(jìn)一步了解分化過程中的分子機(jī)制。此外，這種檢測方法的建立為干細(xì)胞分化研究提供了一種標(biāo)準(zhǔn)化的評估手段，有助于提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。

9、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述qrt-pcr來檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物cd31的表達(dá)包括設(shè)計(jì)目標(biāo)基因定量pcr反應(yīng)引物對cd31基因進(jìn)行擴(kuò)增，以定量分析hamsc向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的效率；所述目標(biāo)基因定量pcr反應(yīng)引物具有seq?id?no:1-seq?id?no:4所示的16s?rdna序列。通過指定seq?id?no:1-seq?id?no:4所示的16s?rdna序列作為目標(biāo)基因定量pcr反應(yīng)引物的一部分，確保了qrt-pcr實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。這種特定序列的使用有助于避免非特異性擴(kuò)增，從而提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。此外，明確引物序列為實(shí)施該技術(shù)方案的研究人員提供了明確的指導(dǎo)，使得該方法可以被其他研究者或?qū)嶒?yàn)室復(fù)制和驗(yàn)證，有助于推動(dòng)該領(lǐng)域內(nèi)知識的積累和技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。

10、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述靜電紡絲薄膜的表面經(jīng)過特殊處理以增加細(xì)胞黏附性，所述特殊處理包括等離子處理或涂層改性。通過特殊處理靜電紡絲薄膜表面，顯著提高了hamsc的細(xì)胞黏附性。這種特殊處理包括等離子處理或涂層改性，能夠有效改善薄膜的表面特性，從而增加細(xì)胞與材料之間的相互作用。等離子處理可以激活材料表面，增加表面粗糙度和化學(xué)活性，而涂層改性則可能涉及覆蓋具有特定生物活性的分子層。這些處理不僅促進(jìn)了初始的細(xì)胞黏附，還可能影響細(xì)胞的增殖和分化行為，為hamsc提供了更加適宜的生長微環(huán)境，進(jìn)而提高了整個(gè)分化過程的效率和效果。

11、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述hamsc的種植密度為每平方厘米104到105個(gè)細(xì)胞，并且種植后在37℃、5％co2的條件下培養(yǎng)。種植密度的精確控制確保了細(xì)胞在培養(yǎng)過程中具有適當(dāng)?shù)目臻g和營養(yǎng)供應(yīng)，避免因過密或過稀導(dǎo)致的細(xì)胞生長抑制或不利的分化結(jié)果。此外，37℃和5％co2的培養(yǎng)條件模擬了人體內(nèi)的生理環(huán)境，有助于維持細(xì)胞的正常代謝和功能狀態(tài)。這些條件的優(yōu)化有助于實(shí)現(xiàn)hamsc向血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效分化，并為后續(xù)的細(xì)胞功能研究和應(yīng)用提供了標(biāo)準(zhǔn)化的培養(yǎng)方法。

12、作為進(jìn)一步的優(yōu)選方案，所述方法進(jìn)一步包括以下步驟：在hamsc種植前，使用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行純度檢測，確保細(xì)胞純度達(dá)到95％以上；在誘導(dǎo)分化過程中，定期使用細(xì)胞活性試劑盒評估細(xì)胞活性，以確保細(xì)胞在培養(yǎng)過程中保持高活性。通過一系列質(zhì)量控制措施，確保了hamsc的高純度和高活性，這對于提高分化效率和獲得功能性血管內(nèi)皮細(xì)胞至關(guān)重要。流式細(xì)胞儀的使用可以在種植前對hamsc進(jìn)行純度檢測，排除可能影響分化效果的雜質(zhì)細(xì)胞，確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，在誘導(dǎo)分化過程中定期使用細(xì)胞活性試劑盒評估細(xì)胞活性，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)并調(diào)整培養(yǎng)條件，防止細(xì)胞因環(huán)境變化或營養(yǎng)不足而受損。這些措施的實(shí)施有助于維持細(xì)胞培養(yǎng)過程中的穩(wěn)定性和可重復(fù)性，為獲得高質(zhì)量的血管內(nèi)皮細(xì)胞提供了保障。

13、綜上所述，與現(xiàn)有技術(shù)相比：

14、首先，本發(fā)明采用了聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(plcl)作為靜電紡絲薄膜的材料，這種材料不僅具有良好的生物相容性和生物可降解性，而且通過靜電紡絲技術(shù)制備的薄膜具有獨(dú)特的三維網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞提供了一個(gè)更加接近天然細(xì)胞外基質(zhì)的生長環(huán)境。這種結(jié)構(gòu)能夠有效促進(jìn)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(hamsc)的黏附、增殖，并在血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的誘導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，從而顯著提高了分化效率。

15、其次，本發(fā)明在細(xì)胞培養(yǎng)過程中采用了精確控制的vegf濃度和周期性更換培養(yǎng)基的方法，保證了分化過程中所需的營養(yǎng)和生長因子的持續(xù)供應(yīng)，同時(shí)避免了代謝廢物的積累，為hamsc的穩(wěn)定分化提供了優(yōu)化的培養(yǎng)條件。此外，通過免疫熒光染色和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qrt-pcr)等檢測手段，本發(fā)明能夠準(zhǔn)確評估hamsc向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的效果，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。

16、最后，本發(fā)明在技術(shù)實(shí)施方面進(jìn)行了創(chuàng)新，包括對靜電紡絲薄膜表面的特殊處理以增加細(xì)胞黏附性，精確控制hamsc的種植密度和培養(yǎng)條件，以及在分化過程中對細(xì)胞純度和活性的定期評估。這些措施進(jìn)一步提高了分化效率，確保了獲得的血管內(nèi)皮細(xì)胞具有高純度和高活性，為心血管疾病的治療和組織工程提供了一種新的細(xì)胞來源。通過這些實(shí)質(zhì)性的技術(shù)創(chuàng)新，本發(fā)明不僅解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，還為干細(xì)胞分化和應(yīng)用開辟了新的道路。