本發(fā)明涉及熒光探針領域，具體涉及一種化合物、熒光團簇、免疫熒光團簇及其制備方法和應用。

背景技術(shù)：

1、免疫熒光染色技術(shù)是指利用熒光分子等發(fā)光劑對抗體進行標記后，借助熒光顯微鏡等儀器，對細胞等生物樣品的特征抗原進行定量分析或定位研究的技術(shù)，在微生物學、免疫學、病理學及免疫組織化學等領域具有重要意義。納米抗體(nanobody,nb)是一種來源于駝科動物的新型抗體，是目前具有完整抗原識別功能的最小分子片段。其相對分子質(zhì)量為12-15kd，僅為傳統(tǒng)抗體的十分之一，可特異性地結(jié)合傳統(tǒng)抗體難以識別接近的細胞表面隱藏抗原，有助于實現(xiàn)高靈敏的免疫熒光染色。

2、納米抗體表面標記熒光分子的信號強度是決定其熒光成像的質(zhì)量與分析結(jié)果的重要因素。傳統(tǒng)熒光分子依靠于特定的熒光基團發(fā)射熒光，在激發(fā)次數(shù)過多、激發(fā)時間過長時，其熒光團結(jié)構(gòu)會發(fā)生不可逆變化，無法再發(fā)出熒光，導致光漂白現(xiàn)象，嚴重影響樣品熒光信號的分析?；ㄝ夹汀⑦量┡鹦蜔晒夥肿泳哂幸欢ǖ目构馄啄芰?，但其疏水性較強，將其偶聯(lián)在小尺寸納米抗體表面時易引發(fā)抗體變性、失活。碳量子點、上轉(zhuǎn)換納米材料、稀土配合物等熒光材料具有良好的抗光漂白能力，但也存在各種不足，比如熒光信號不穩(wěn)定、量子產(chǎn)率低、檢測成本高昂、制備過程復雜。

3、聚集誘導發(fā)光(aie，aggregation?induced?emission)材料是一種新型熒光材料，其特性在于通過可分子聚集的方式限制分子內(nèi)部運動產(chǎn)生的熱能，進而促使光能輸出比例，從而產(chǎn)生熒光信號。aie材料聚集態(tài)產(chǎn)生的熒光信號具有穩(wěn)定性好、抗光漂白能力強的優(yōu)勢，在生物成像領域廣受期待。四苯基乙烯是一種廉價易得的aie分子母體，可在聚集態(tài)下發(fā)射熒光信號。但是四苯基乙烯疏水性極強，僅溶解于有機溶劑。也就是說，只有在含乙醇、dmso等有機溶劑的反應環(huán)境中，aie分子母體才能與納米抗體進行偶聯(lián)。但是，有機溶劑會破壞納米抗體結(jié)構(gòu)，從而影響納米抗體活性，進而影響免疫熒光染色的效果。因此，aie分子母體雖具有上述優(yōu)勢，但其非水溶性阻礙了其在免疫熒光染色的應用。

4、發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，只有當aie分子能在非有機溶劑依賴的反應環(huán)境中實現(xiàn)與納米抗體偶聯(lián)，才能真正實現(xiàn)aie分子在納米抗體免疫熒光染色應用。為達此目標，發(fā)明人嘗試探索如何解決具有疏水特性的aie分子與納米抗體偶聯(lián)時必須依賴有機溶劑環(huán)境的問題。諸如在水環(huán)境下實現(xiàn)偶聯(lián)，水環(huán)境如純水、磷酸鹽緩沖液(pbs)、2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(mes)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(tris)，則可避免有機試劑對納米抗體結(jié)構(gòu)破壞，保證納米抗體活性，從而實現(xiàn)高靈敏的免疫熒光染色。

5、為實現(xiàn)上述在水環(huán)境下進行與納米抗體偶聯(lián)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)可通過將aie分子改性為完全水溶性，則可實現(xiàn)上述目的。文獻(acs?appl.mater.interfaces?2021,13,17,19625–19632)通過引入磺酸基(-so3)增加了四苯基乙烯的水溶性，雖提高了分子的親水性，但也無法實現(xiàn)其在100％純水溶劑中的溶解，不是完全水溶性的aie分子。因此，將其或者其團簇與納米抗體偶聯(lián)，仍必須在含有有機溶劑的反應環(huán)境中，將不能實現(xiàn)aie分子在納米抗體免疫熒光染色中應用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決將aie分子或者其團簇與納米抗體偶聯(lián)而不使用有機溶劑作為反應環(huán)境，以在水環(huán)境實現(xiàn)，從而避免有機溶劑在偶聯(lián)中對納米抗體結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，避免該偶聯(lián)影響納米抗體活性，導致難以染色的問題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明第一方面提供一種化合物(utps2)，其中，所述化合物如式(ⅰ)所示：

3、

4、本發(fā)明第二方面提供一種化合物的制備方法，其中，包括以下步驟：

5、s110.將乙醇鈉及乙醇的混合溶液加入第一混合溶液中得第二混合溶液；

6、將1,4-丁磺酸內(nèi)酯及乙醇的混合溶液加入所述第二混合溶液中進行第一反應；

7、再進行第一純化得第一中間產(chǎn)物，第一中間產(chǎn)物如式(?、?所示：

8、

9、其中，所述第一混合溶液為惰性氣氛下的[1,1-二(4-溴苯基)-2-二(4-羥基苯基)]乙烯及乙醇的混合溶液；

10、s120.將4-吡啶基硼酸、氫氧化鉀、四(三苯基膦)鈀加入所述第一中間產(chǎn)物及乙腈的混合溶液中進行第二反應；

11、再進行第二純化得第二中間產(chǎn)物，第二中間產(chǎn)物如式(?、、?所示：

12、

13、s130.惰性氣氛下將所述第二中間產(chǎn)物與5-氯甲基尿嘧啶溶解在n,n-二甲基甲酰胺中進行第三反應；

14、再進行第三純化后得上述第一方面所述的化合物。

15、本發(fā)明第三方面提供一種熒光團簇的制備方法，其中，包括將上述第一方面所述化合物、單鏈dna、溶劑進行混合制得所述熒光團簇。

16、本發(fā)明第四方面提供上述第三方面所述制備方法制得的熒光團簇(utps2/ssdna)。

17、本發(fā)明第五方面提供一種免疫熒光團簇的制備方法，其中，在所述水環(huán)境下將上述第四方面所述熒光團簇與納米抗體偶聯(lián)。

18、本發(fā)明第六方面提供上述第五方面所述制備方法制得的免疫熒光團簇(egfr?nb-utps2/ssdna)。

19、本發(fā)明第七方面提供上述第一方面所述化合物、上述第四方面所述熒光團簇或上述第六方面所述免疫熒光團簇在制備免疫熒光染色試劑上的應用。

20、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果：

21、在第一方面上，本發(fā)明制備化合物utps2是一種具備完全水溶性的aie分子，由其制備的熒光團簇可在純水條件下與納米抗體偶聯(lián)，與現(xiàn)有技術(shù)的aie分子必須使用有機溶劑作為偶聯(lián)環(huán)境才能與納米偶聯(lián)相比，避免了有機試劑對納米抗體結(jié)構(gòu)破壞的現(xiàn)象，從而避免降低納米抗體活性的問題，能夠真正實現(xiàn)aie分子用于免疫熒光染色。

22、在第二方面上，本發(fā)明制備化合物熒光發(fā)射峰與吸收峰之間存在較大斯托克斯位移，有利于提高熒光成像的信噪比。

23、在第三方面上，本發(fā)明利用a-u堿基互補配對的精準識別作用制備熒光團簇，提供的末端修飾的utps2/ssdna熒光團簇不僅具有完全的水溶性，且活性官能團明確可控，可以任意偶聯(lián)在目標抗體表面而不影響其活性，具有通用性。同時，其還具有熒光亮度高、抗光漂白能力強的優(yōu)勢。

24、在第四方面上，本發(fā)明提供的nb-utps2/ssdna免疫熒光團簇在免疫熒光染色應用方面，具有具有水溶性好、抗光漂白、熒光信號穩(wěn)定、簡便易得的優(yōu)勢，從而實現(xiàn)靈敏、穩(wěn)定的免疫熒光染色及分析。

技術(shù)特征：

1.一種化合物，其特征在于，所述化合物如式(ⅰ)所示：

2.一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，

5.根據(jù)權(quán)利要求2-4中任意一項所述的制備方法，其特征在于，

6.一種熒光團簇的制備方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求1所述化合物、單鏈dna、溶劑進行混合制得所述熒光團簇；

7.權(quán)利要求6所述制備方法制得的熒光團簇。

8.一種免疫熒光團簇的制備方法，其特征在于，在所述水環(huán)境下將權(quán)利要求7所述熒光團簇與納米抗體偶聯(lián)。

9.權(quán)利要求8所述制備方法制得的免疫熒光團簇。

10.權(quán)利要求1所述化合物、權(quán)利要求7所述熒光團簇或權(quán)利要求9所述免疫熒光團簇在制備免疫熒光染色試劑上的應用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及熒光探針領域，具體涉及一種化合物、熒光團簇、免疫熒光團簇及其制備方法和應用，該化合物如式(Ⅰ)所示，化合物具備完全水溶性，具有高熒光成像的信噪比，由化合物制備的熒光團簇也具有完全水溶性，且活性官能團明確可控，熒光亮度高、抗光漂白能力強，熒光團簇還能夠在純水條件下與納米抗體偶聯(lián)得到免疫熒光團簇而不影響抗體活性，可用于細胞免疫熒光染色探針。

技術(shù)研發(fā)人員：姜文寧
受保護的技術(shù)使用者：遼寧警察學院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6