本發(fā)明涉及α-淀粉酶的變體、編碼這些變體的多核苷酸和產(chǎn)生這些變體的方法。

背景技術(shù)：

1、α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)由一組酶構(gòu)成，這些酶催化淀粉以及其他直鏈和支鏈1,4-糖苷寡糖和多糖的水解。

2、α-淀粉酶在工業(yè)上用于若干種已知應(yīng)用的用途具有悠久歷史，這些應(yīng)用如洗滌劑、烘焙、釀造、淀粉液化和糖化，例如在高果糖糖漿的制備中或用作從淀粉生產(chǎn)乙醇的一部分。α-淀粉酶的這些應(yīng)用和其他應(yīng)用是已知的并且利用了衍生自微生物的α-淀粉酶，特別是細菌α-淀粉酶。

3、屬于首先被使用的細菌α-淀粉酶是來自地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)的α-淀粉酶，還稱作termamyl，該termamyl已經(jīng)被充分表征并且這種酶的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定。堿性淀粉酶(如aa560)形成已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于洗滌劑中的一個特定組的α-淀粉酶。這些已知的細菌淀粉酶中許多已經(jīng)經(jīng)修飾以改善它們在特定應(yīng)用中的功能性。

4、芽孢桿菌屬淀粉酶，如termamyl、aa560(wo?2000/060060)和sp707(由tsukamoto等人,1988,biochem.biophys.res.comm.[生物化學和生物物理研究通訊]151:25-31描述)形成已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于洗滌劑中的一個特定組的α-淀粉酶。已經(jīng)對這些淀粉酶進行修飾以改進其在洗滌劑中的穩(wěn)定性。例如wo?96/23873披露了缺失sp707(wo?96/23873的seq?id?no:7)的氨基酸181+182或氨基酸183+184以改進此淀粉酶的穩(wěn)定性。wo?96/23873進一步披露了通過用例如亮氨酸取代m202來修飾sp707淀粉酶以使該分子對氧化保持穩(wěn)定。因而，修飾淀粉酶來改進某些特性是已知的。

5、出于環(huán)境原因，在洗滌、餐具洗滌和/或清潔過程中降低溫度已經(jīng)日益重要。然而，大多數(shù)酶(包括淀粉酶)具有在低溫洗滌中通常所用的溫度以上的最適溫度。α-淀粉酶是用于洗滌劑組合物中的關(guān)鍵酶并且對于衣物洗滌或餐具洗滌期間去除淀粉污漬，其用途已經(jīng)變得日益重要。因此，重要的是找到如下α-淀粉酶變體，它們在溫度降低時保留其洗滌性能、污漬去除作用和/或活性。然而，盡管當前洗滌劑酶組合物的效率，仍然存在著難以完全去除的許多污漬。這些問題因低(例如，冷水)洗滌溫度的增加使用和較短的洗滌周期而加劇。因而，需要獲得這樣的淀粉分解酶，這些酶可以在低溫下發(fā)揮功能并同時保留或增加其他所希望的特性如比活性(淀粉分解活性)、穩(wěn)定性和/或洗滌性能。

6、因此，本發(fā)明的一個目的是提供可在低溫如在5℃-40℃用于洗滌、餐具洗滌和/或清潔過程中的α-淀粉酶變體。本發(fā)明的另一個目的是提供與親本α-淀粉酶相比或與seq?idno:1、2、3、4、5、6、7或8中任一項的α-淀粉酶相比在低溫具有改進的洗滌性能的α-淀粉酶變體。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及親本α-淀粉酶的變體，其中該變體包含(i)在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的109、1、7、280、284、320、323和391的一個或多個位置處的修飾，以及任選地在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一個或多個位置中的修飾，(ii)該變體與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且(iii)該變體具有α-淀粉酶活性。

2、本發(fā)明還涉及編碼根據(jù)本發(fā)明的變體的多核苷酸、包含編碼根據(jù)本發(fā)明的變體的多核苷酸的核酸構(gòu)建體、包含編碼根據(jù)本發(fā)明的變體的多核苷酸的表達載體、和包含編碼根據(jù)本發(fā)明的變體的多核苷酸的宿主細胞。

3、本發(fā)明還涉及產(chǎn)生α-淀粉酶變體的方法，該方法包括：(a)在適合于該變體表達的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細胞；和(b)回收該變體。

4、本發(fā)明進一步涉及獲得α-淀粉酶變體的方法，該方法包括：在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的109、7、1、391、280、284、320和323的一個或多個位置處，以及任選地在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一個或多個位置中向親本α-淀粉酶引入修飾，其中各修飾獨立地為取代或缺失，且該變體具有α-淀粉酶活性；以及回收該變體。

5、本技術(shù)進一步涉及以下實施方案：

6、1.一種親本α-淀粉酶的變體，其中所述變體包含

7、(i)在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一個或多個位置處的修飾，以及任選地在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一個或多個位置中的修飾，

8、(ii)所述變體與seq?id?no:1、2、3、4、5、6、7或8中所示的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、如至少95％、如至少97％，但小于100％的序列同一性，并且

9、(iii)所述變體具有α-淀粉酶活性。

10、2.根據(jù)實施方案1所述的變體，其中該修飾是缺失或取代。

11、3.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的至少一個位置中包含修飾。

12、4.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、140、181、182、183、184、195、206、243、260、280、284、304、320、323、391和476的至少一個位置中包含修飾。

13、5.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述一個或多個修飾是取代。

14、6.根據(jù)實施方案1至4中任一項所述的變體，其中所述一個或多個修飾中的至少一個是缺失。

15、7.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體包含選自下組的至少兩個位置中的修飾，該組由以下組成：1、109和391。

16、8.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述一個或多個修飾選自下組，該組由以下組成：x1*、x1a、x7a、x7k、x7e、x7n、x7q、x7l、x7d、x109a、x109s、x140y、x181*、x182*、x183*、x184*、x195f、x206y、x243f、x260g、x280s、x284h、x284r、x284f、x304r、x320a、x320m、x320t、x320v、x320s、x323n、x323r、x323s、x323k、x391a、x391v和x476k。

17、9.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體具有改進的性能，如改進的洗滌性能。

18、10.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體與該親本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％的序列同一性。

19、11.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中修飾的數(shù)目為1至30，例如1至20，例如1至10和1至5，如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個修飾。

20、12.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體在選自下組位置的位置中包含修飾，該組由以下組成：x1+x7；x1+x109；x1+x280；x1+x284；x1+x320；x1+x323；x1+x391；x109+x280；x109+x284；x109+x320；x109+x323；x109+x391；x7+x109；x7+x280；x7+x284；x7+x320；x7+x323；x7+x391；x280+x284；x280+x320；x280+x323；x280+x391；x284+x320；x284+x323；x284+x391；x320+x323；x320+x391；和x323+x391，其中根據(jù)seq?id?no:1進行編號。

21、13.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述變體在對應(yīng)于seq?id?no:2中所示的氨基酸序列的位置的位置中包含修飾，這些修飾選自下組，該組由以下組成：

22、h1*+g109a+n280s+e391a；

23、h1*+g7k+g109a+n280s+e391a；

24、h1*+g7e+g109a+n280s+e391a；

25、h1*+g7n+g109a+n280s+e391a；

26、h1*+g7q+g109a+n280s+e391a；

27、h1*+g7l+g109a+n280s+e391a；

28、h1*+g7d+g109a+n280s+e391a；

29、h1*+g109a+n280s+k320a+e391a；

30、h1*+g109a+n280s+k320m+e391a；

31、h1*+g109a+n280s+k320t+e391a；

32、h1*+g109a+n280s+k320v+e391a；

33、h1*+g109a+n280s+m323r+e391a；

34、h1*+g109a+n280s+k320s+e391a；

35、h1*+g109a+n280s+e391v；

36、h1*+g109a+w284r+e391a；

37、h1*+g109a+w284f+e391a；

38、h1*+g109a+n280s+k320a+m323s+e391a；

39、h1*+g109a+n280s+w284f+e391a；

40、h1*+g109a+n280s+m323n+e391a；

41、h1*+g109a+n280s+m323k+e391a；

42、h1*+g109s+n280s+e391a；

43、h1*+g109a+w284h+e391a；

44、h1*+g109a+n280s+k320a+m323n+e391a；

45、h1*+g7a+g109a+n280s+e391a；

46、h1*+g7a+g109a+n280s+w284h+k320a+m323n+e391a；

47、g7a+w284h+k320a+m323n；

48、g7a+k320a+m323n；

49、k320a；

50、g7a+k320a；

51、h1*+g7a+g109a+n280s+e391a；

52、h1*+g109a+n280s+w284h+e391a；

53、h1*+g109a+n280s+m323s+e391a；

54、h1*+g7a+g109a+n280s+k320a+e391a；

55、h1*+g7a+g109a+n280s+m323s+e391a；

56、h1*+g7a+g109a+n280s+m323n+e391a；

57、h1*+g7a+g109a+n280s+w284f+e391a；

58、h1*+g7a+g109a+n280s+w284r+e391a；

59、h1*+g7a+g109a+n280s+k320a+m323s+e391a；

60、h1*+g7a+g109a+w284r+e391a；和

61、h1*+g7a+g109a+n280s+k320a+m323n+e391a。

62、14.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述親本α-淀粉酶選自seq?idno:1、2、3、4、5、6、7和8中所示的氨基酸序列，或與seq?id?no:1和2中所示的氨基酸序列中的任一項具有至少90％，如至少92％、如至少95％、如至少97％、如至少98％、如至少99％或100％的序列同一性的任何α-淀粉酶。

63、15.根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體，其中所述親本α-淀粉酶包含seq?idno:1和2中所示的氨基酸序列或由其組成。

64、16.一種多核苷酸，該多核苷酸編碼根據(jù)前述實施方案中任一項所述的變體。

65、17.一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體包含根據(jù)實施方案16所述的多核苷酸。

66、18.一種表達載體，該表達載體包含根據(jù)實施方案16所述的多核苷酸。

67、19.一種宿主細胞，該宿主細胞包含根據(jù)實施方案16所述的多核苷酸。

68、20.一種產(chǎn)生α-淀粉酶變體的方法，該方法包括：

69、a.在適合于表達所述變體的條件下培養(yǎng)根據(jù)實施方案19所述的宿主細胞；和

70、b.回收所述變體。

71、21.一種用于獲得α-淀粉酶變體的方法，該方法包括在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置109、1、7、280、284、320、323和391的一個或多個位置處，以及任選地在對應(yīng)于seq?id?no:1中所示的氨基酸序列的位置140、181、182、183、184、195、206、243、260、304和476的一個或多個位置中向親本α-淀粉酶引入修飾，其中各修飾獨立地為取代或缺失，且所述變體具有α-淀粉酶活性；以及回收所述變體。