本技術(shù)涉及細胞表面展示技術(shù)，尤其涉及在酵母細胞表面展示mhc-ii與抗原肽的三聚體的改進技術(shù)方案。

背景技術(shù)：

1、t細胞調(diào)控的免疫反應對許多疾病都起到重要作用，包括腫瘤、自身免疫、移植排斥和傳染病等。其中，作為適應性免疫的中央調(diào)控官，cd4+t細胞的激活需要通過其受體(tcr)特異性的識別由主要組織相容性復合體ii類(mhc-ii)所結(jié)合并呈遞的抗原或病原肽。mhc-ii是由α和β鏈組成的異二聚體跨膜蛋白，每條鏈包含兩個結(jié)構(gòu)域，這些蛋白捕捉專職抗原呈遞細胞(apc)內(nèi)部處理的抗原肽，并將其呈現(xiàn)在apc表面供cd4+t細胞識別以啟動下游的免疫反應。由α1和β1結(jié)構(gòu)域形成的mhc-ii的肽結(jié)合槽包含幾個袋狀的空間結(jié)構(gòu)，這些“袋”喜歡容納抗原肽注冊段(register)上的“錨”殘基的特定側(cè)鏈。因此，mhc-ii可容納的肽register具備一定泛性，換句話說，能夠結(jié)合并呈遞許多不同的抗原肽，但錨-袋的特殊凸凹空間結(jié)構(gòu)在一定程度上限制了給定mhc-ii所呈遞的肽的種類。因此，深入了解mhc-ii的肽結(jié)合功能進而確定各種肽register各個位點殘基偏好對于腫瘤新抗原發(fā)現(xiàn)、自身免疫調(diào)節(jié)、疫苗設(shè)計、傳染病預防和移植排斥緩解等問題至關(guān)重要。

2、人體的mhc或稱為人類白細胞抗原(hla)，它是自然界中已知的高多態(tài)性的糖修飾的穿膜蛋白。這種多態(tài)性與自然存在的多種hla單倍型(haplotype)、基因亞型(dr、dq、dp)以及成千上萬種等位基因有關(guān)，而且，每種等位基因所翻譯表達出來的mhc蛋白各自可以結(jié)合并呈遞多種肽片段。因此，研究各種mhc-ii的肽結(jié)合特性和確定各種肽抗原表位圖譜是極具挑戰(zhàn)性的問題，需要高通量高內(nèi)涵的基因蛋白工程方法。常規(guī)方法中，一些從不同的表達系統(tǒng)(如b細胞系、昆蟲細胞、酵母或大腸桿菌)中純化可溶性重組mhc-ii分子，然后分析這些分子與不同的肽的結(jié)合強弱；另一些研究側(cè)重評估肽與apc表面表達的mhc-ii的結(jié)合。這些方法中所用到的肽片段或通過化學方法固相合成或通過基因方法如噬菌體展示產(chǎn)生。這種低效的肽片段合成，勞動密集型的可溶性蛋白制備、冗長的結(jié)合試驗或產(chǎn)生的非定量數(shù)據(jù)(如肽的豐度)限制了這些方法在大量現(xiàn)有mhc-ii等位基因中繪制特異性結(jié)合表位肽圖譜的效率和產(chǎn)量。換一種思路，具有定向進化優(yōu)勢的真核細胞表面展示技術(shù)可用于表達指定mhc-ii等位基因，從而在細胞表面進行肽結(jié)合試驗。作為一個真核單細胞系統(tǒng)，酵母具有簡單的分子克隆和真核翻譯后修飾蛋白質(zhì)表達的優(yōu)勢，因此，它是開發(fā)這種方法的優(yōu)選平臺。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)提供了可展示主要組織相容性復合體與抗原肽的三聚體的工程化細胞，編碼所述三聚體的核酸，以及所述工程化細胞的用途及其制備方法。所述工程化細胞可用于mhc-ii目標肽的準確高效的高通量篩選。

2、具體地，本技術(shù)涉及：一種細胞，其包括主要組織相容性復合體(mhc)以及單鏈結(jié)構(gòu)域，其中所述復合體包含α鏈和β鏈，其中，

3、所述α鏈連接至第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以形成第一融合蛋白，

4、所述β鏈連接至第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以形成第二融合蛋白，

5、所述單鏈結(jié)構(gòu)域非共價結(jié)合所述α鏈和β鏈，所述第一融合蛋白結(jié)合所述第二融合蛋白形成所述復合體，并且所述復合體與單鏈結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)成的三聚體，其中，

6、所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以增強或促進形成所述復合體與單鏈結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)成的三聚體。

7、進一步的，所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域非共價結(jié)合所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域；或者所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域共價連接所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述共價鍵優(yōu)選為二硫鍵。

8、進一步的，所述細胞是酵母細胞。

9、進一步的，所述單鏈結(jié)構(gòu)域與所述細胞表面上的分子以共價融合的方式結(jié)合至所述細胞的表面。

10、進一步的，其中所述α鏈或所述β鏈通過與所述單鏈結(jié)構(gòu)域非共價結(jié)合的方式結(jié)合至所述細胞表面上的所述分子。

11、進一步的，其中所述分子是蛋白質(zhì)。

12、進一步的，其中所述蛋白質(zhì)對于所述細胞是內(nèi)源性的。

13、進一步的，其中所述蛋白質(zhì)為aga2p、a-凝集素、α-凝集素、絮凝素、cwp1p、cwp2p或tip1p。

14、進一步的，其中所述蛋白質(zhì)是aga2p。

15、進一步的，其中所述aga2p的氨基酸序列如seq?id?no:1所示。

16、進一步的，其中所述單鏈結(jié)構(gòu)域為長度9～30個氨基酸的肽段，并且所述單鏈結(jié)構(gòu)域包含至少一個連續(xù)的長度為9個氨基酸的可被所述復合體特異性識別的注冊肽(register)或可被所述復合體結(jié)合的注冊肽變體(variant)，優(yōu)選所述注冊肽或其變體選自如seq?id?no:20-38中任一項所示的氨基酸序列。

17、進一步的，其中所述單鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列如seq?id?no:2-6或46-77中任一項所示。

18、進一步的，所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域為第一亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域為第二亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其中，形成完整亮氨酸拉鏈的所述第一亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域與所述第二亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域可在所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中互換使用；或者

19、所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域為fca結(jié)構(gòu)域，所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域為fcb結(jié)構(gòu)域，其中，形成fcab二聚體的所述fca結(jié)構(gòu)域與所述fcb結(jié)構(gòu)域可在所述第一融合蛋白和所述第二融合蛋白中互換使用。

20、進一步的，所述第一亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seq?id?no:7或seq?idno:8或seq?id?no:9或seq?id?no:10所示；

21、相應的，所述第二亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為seq?id?no:8或seq?id?no:7或seq?id?no:10或seq?id?no:9所示。

22、進一步的，所述fca結(jié)構(gòu)域與所述fcb結(jié)構(gòu)域為相同的或不同的氨基酸序列，優(yōu)選選自如seq?id?no：11-19所示的氨基酸序列中的任一種；

23、優(yōu)選所述fc?a結(jié)構(gòu)域和fcb結(jié)構(gòu)域為能夠提高所述復合體表達展示量和/或拷貝數(shù)量；

24、優(yōu)選所述fca結(jié)構(gòu)域只包含第一ch3結(jié)構(gòu)域，所述fcb結(jié)構(gòu)域只包含第二ch3結(jié)構(gòu)域；或者

25、優(yōu)選所述fca結(jié)構(gòu)域包含第一ch2結(jié)構(gòu)域和第一ch3結(jié)構(gòu)域，所述fcb結(jié)構(gòu)域包含第二ch2結(jié)構(gòu)域和第二ch3結(jié)構(gòu)域；

26、進一步優(yōu)選第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述第一ch2結(jié)構(gòu)域和第一ch3結(jié)構(gòu)域通過接頭連接，第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的所述第二ch2結(jié)構(gòu)域和第二ch3結(jié)構(gòu)域通過接頭連接。

27、進一步的，所述fca結(jié)構(gòu)域和所述fcb結(jié)構(gòu)域中的任一者或兩者包含一個或多個氨基酸修飾，所述修飾能實現(xiàn)以下任一種或兩種或三種：

28、(1)增強或穩(wěn)定所述fca結(jié)構(gòu)域和/或所述fcb結(jié)構(gòu)域本身(“fcs”)，

29、(2)增強或穩(wěn)定所述fca結(jié)構(gòu)域與所述fcb結(jié)構(gòu)域之間的共價或非共價結(jié)合(“fcm”)，

30、(3)減少或避免所述fca結(jié)構(gòu)域與所述fcb結(jié)構(gòu)域錯配所致的所述α鏈和β鏈的錯配(“fcn”)。

31、進一步的，所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述α鏈的c末端，所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域連接至所述β鏈的c末端，優(yōu)選啟動表達所述第一融合蛋白和第二融合蛋白的信號肽為spp?sp或aga2?sp，進一步優(yōu)選所述aga2?sp的氨基酸序列如seq?id?no:39所示，所述sppsp的氨基酸序列如seq?id?no:45所示。

32、進一步的，所述復合體為mhc?i類分子或mhc?ii類分子，優(yōu)選所述復合體為hla?i類分子或hla?ii類分子。

33、進一步的，所述α鏈是由hla-dra*01或hla-dra族其他等位基因編碼，所述β鏈是由hla-drb1*01或hla-drb1*03或hla-drb1*04或hla-drb1*15或hla-drb族其他等位基因編碼；或者

34、所述α鏈是由hla-dqa1*01或hla-dqa1*03或hla-dqa1*05或hla-dqa1族其他等位基因編碼，所述β鏈是由hla-dqb1*02或hla-dqb1*03或hla-dqb1*05或hla-dqb1*06或hla-dqb1族其他等位基因編碼；或者

35、所述α鏈是由hla-dpa1*01:03或hla-dpa1*02:02或hla-dpa1族其他等位基因編碼，所述β鏈是由hla-dpb1*01:01或hla-dpb1*02:01或hla-dpb1*04:01或hla-dpb1*04:02或hla-dpb1族其他等位基因編碼。

36、一種編碼主要組織相容性復合體(mhc)的核酸，其中所述復合體包含α鏈和β鏈，其中所述α鏈連接至第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述β鏈連接至第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述α鏈和β鏈通過非共價結(jié)合單鏈結(jié)構(gòu)域，并且所述第一蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合所述第二蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以增強或促進形成所述復合體與單鏈結(jié)構(gòu)域之間構(gòu)成的三聚體。

37、進一步的，其所編碼的主要組織相容性復合體是前述涉及的主要組織相容性復合體(mhc)。

38、一種主要組織相容性復合體(mhc)的制備方法，所述方法包括：

39、用前述的核酸和包括編碼單鏈結(jié)構(gòu)域的核酸轉(zhuǎn)化細胞，

40、以及在表達前述涉及的復合體的條件下培養(yǎng)所述細胞。

41、進一步的，其中所述細胞是酵母細胞。

42、一種鑒定結(jié)合主要組織相容性復合體(mhc)的肽的方法，所述方法包括：

43、i)使前述的細胞展示的單鏈結(jié)構(gòu)域文庫，

44、以及ii)檢測前述涉及的單鏈結(jié)構(gòu)域展示的細胞文庫中的單克隆表面的三聚體，從而鑒定前述涉及的復合體的結(jié)合肽。

45、進一步的，其中所述單鏈結(jié)構(gòu)域包含肽，或肽的突變體，或肽的突變體文庫，或肽的混合物。

46、進一步的，其中所述肽，或肽的突變體，或肽的突變體文庫，或肽的混合物非共價結(jié)合所述復合體。

47、一種能夠與主要組織相容性復合體(mhc)結(jié)合的注冊肽或其變體，其中，所述注冊肽或其變體選自如seq?id?no:20-38中任一項所示的氨基酸序列。