本發(fā)明屬于核酸檢測，具體涉及一種電化學生物傳感器及其制備方法與應用。

背景技術：

1、目前，癌癥是導致人類疾病死亡的主要原因之一。癌癥的誘因復雜，是遺傳因素和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。在癌癥的診斷與治療中，早發(fā)現(xiàn)早治療能夠大大提高患者的五年生存率。近幾年來，隨著一些microrna、特異性抗原、表面蛋白等腫瘤生物標志物的發(fā)現(xiàn)，癌癥早期診斷技術迅速發(fā)展。micrornas(mirnas)是一類長度為18-25nt的非編碼單鏈rnas，已被證實在一些生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，包括胚胎發(fā)育、細胞分化、組織發(fā)育、細胞凋亡、腫瘤進展、病毒繁殖和細胞死亡。近年來，mirnas被認為是疾病診斷的重要腫瘤標志物，因為許多研究證據(jù)表明，各種人類疾病與mirnas表達失調(diào)之間存在密切關系。因此，mirnas進行快速、高效的臨床檢測需求漸增，對進一步研究mirnas的功能，進而作為腫瘤早期診斷和預后的診斷依據(jù)的需求迫切。

2、在過去的幾十年里，傳統(tǒng)的技術，包括northern?blotting、基因芯片技術、聚合酶鏈式反應(pcr)和熒光原位雜交(fish)技術，已經(jīng)被開發(fā)用于mirnas檢測。然而，這些方法在實際分析中出現(xiàn)了明顯的局限性，如northern?blotting的敏感性差強人意，而基因芯片的開發(fā)和使用需要專業(yè)技術人員。pcr因其高靈敏度而成為體外和細胞內(nèi)基因檢測中最常用和最可靠的方法，也被公認為是金標準。但pcr技術面臨著一個不可避免的事實：對mirna的定量檢測需要經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄步驟，步驟繁瑣且專業(yè)要求高。在這種情況下，設計實現(xiàn)mirnas快速精準的擴增技術是非常必要的。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明提出一種用于檢測mir-205-5p的cha系統(tǒng)。

2、本發(fā)明還提出一種電化學生物傳感器。

3、本發(fā)明還提出上述電化學傳感器的制備方法。

4、本發(fā)明還提出一種試劑盒。

5、本發(fā)明還提出上述用于檢測mir-205-5p的cha系統(tǒng)、電化學生物傳感器或試劑盒的應用。

6、本發(fā)明還提出一種非診斷目的的mir-205-5p的檢測方法。

7、根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提出了一種用于檢測mir-205-5p的cha系統(tǒng)，包括h1和h2；

8、所述h1的核苷酸序列如seq?id?no.2所示；

9、所述h2的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cha系統(tǒng)通過將mir-205-5p與h1和h2反應制備得到。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h1的濃度為0.5-2μm。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h2的濃度為0.5-2μm。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述反應時間為1-3h。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述反應溫度為40-45℃。

15、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提出了一種電化學生物傳感器，所述電化學生物傳感器包括上述cha系統(tǒng)。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述電化學生物傳感器還包括alp-h3和h4。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述alp-h3中h3的序列如seq?id?no:4所示。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述alp-h3由以下方法制備得到：將鏈霉親和素-堿性磷酸酶加入h3中，30-40℃反應1-3h，制備得到。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h3的濃度為0.5-2μm。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述鏈霉親和素-堿性磷酸酶溶液的濃度為8-12μg/ml。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h4的序列如seq?id?no:5所示。

22、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提出了一種上述電化學生物傳感器的制備方法，包括以下步驟：

23、(1)將絲網(wǎng)印刷電極，加入haucl4溶液中，進行沉積，得到第一修飾電極；

24、(2)將探針與所述第一修飾電極反應，得到第二修飾電極；

25、(3)將所述第二修飾電極與bsa反應，得到第三修飾電極；

26、(4)將上述cha系統(tǒng)加入所述第三修飾電極反應，得到第四修飾電極；

27、(5)將alp-h3和h4加入所述第四修飾電極反應，得到第五修飾電極；

28、(6)將含有銀離子和堿性磷酸酯的溶液加入所述第五修飾電極反應，得到電化學傳感器。

29、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述絲網(wǎng)印刷電極還包括預處理的步驟：在使用前浸泡于酸性溶液中，使用cv法進行預處理，在-0.2～1.0v的電壓下，以80-120mv/s的速率掃描16-25圈。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述酸性溶液包括濃度為0.3-0.8m的硫酸溶液。

31、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述haucl4溶液的質(zhì)量分數(shù)為0.005％-0.015％。

32、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述沉積條件為在-0.8～-0.3v恒電位下電沉積100-140s。

33、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的序列如seq?id?no:6所示。

34、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針上還修飾有c6hs-sh。

35、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的添加濃度為0.5-1.5μm；添加體積為8-12μl。

36、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述bsa的添加濃度為0.05％-0.2％。

37、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述第二修飾電極與bsa反應的條件為30-40℃封閉0.5-2h。

38、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cha系統(tǒng)的添加體積為8-12μl。

39、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述cha系統(tǒng)加入所述第三修飾電極反應的條件為：30-40℃反應1-3h。

40、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述alp-h3中h3的序列如seq?id?no:4所示。

41、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h3上還修飾有teg-biotin。

42、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述alp-h3由以下方法制備得到：將鏈霉親和素-堿性磷酸酶加入h3中，30-40℃反應1-3h，制備得到。

43、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h3的濃度為0.5-2μm。

44、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述鏈霉親和素-堿性磷酸酶溶液的濃度為8-12μg/ml。

45、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h4的序列如seq?id?no:5所示。

46、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述alp-h3的濃度為0.5-2μm。

47、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述h4的濃度為0.5-2μm。

48、在本發(fā)明的一些實施方式中，alp-h3和h4加入所述第四修飾電極反應的條件為：30-40℃反應1-3h。

49、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述含有銀離子和堿性磷酸酯的溶液中，堿性磷酸酯的濃度為15-25mm。

50、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述含有銀離子和堿性磷酸酯的溶液中，銀離子的濃度為90-110mm。

51、在本發(fā)明的一些實施方式中，含有銀離子和堿性磷酸酯的溶液加入所述第五修飾電極反應的條件為：30-40℃反應0.1-1h。

52、在本發(fā)明的一些實施方式中，還包括將所述電化學反應傳感器進行洗滌的步驟，所述步驟包括：采用0.05-0.2m甘氨酸-naoh溶液對電化學反應傳感器進行洗滌。

53、根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提出了一種試劑盒，所述試劑盒包括上述cha系統(tǒng)或電化學反應傳感器。

54、根據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明還提出上述用于檢測mir-205-5p的cha系統(tǒng)、電化學生物傳感器或試劑盒的應用，所述應用為在檢測核酸中的應用。

55、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述核酸包括mir-205-5p。

56、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述核酸包括腫瘤細胞核酸。

57、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述腫瘤包括肺癌、肝癌細胞和乳腺癌。

58、根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提出了一種非診斷目的的mir-205-5p的檢測方法，所述方法包括以下步驟：將待測樣本核酸采用上述電化學生物傳感器進行檢測。

59、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測采用lsv法進行電化學檢測。

60、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測采用的掃描電壓范圍為-0.1-0.6v，脈沖幅度為90-110mv。

61、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述檢測采用的電解質(zhì)中含有濃度為0.5-0.7m的kno3和濃度為0.05-0.2m的hno3。

62、根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，至少具有以下有益效果：本發(fā)明方案當靶標mir-205-5p存在反應系統(tǒng)中，h1通過堿基互補配對將發(fā)卡結(jié)構(gòu)打開，一部分單鏈與h2暴露的腳趾部分結(jié)合，雜交形成mir/h1/h2復合物。與此同時，mir-205-5p通過鏈置換反應脫落。在經(jīng)過一個cha循環(huán)后，形成了dsdna(h1-h2)，脫落的mir-205-5p可以啟動下一個cha循環(huán)，反應形成更多的dsdna復合物，以實現(xiàn)核酸信號放大。cha循環(huán)產(chǎn)物是是電化學生物傳感器的重要組成部分。因為它不僅與輸入分析物的量有關，還能激發(fā)后續(xù)的h3-alp和h4在電極表面的hcr。使用spce作為工作電極通過電沉積的方式將大量的au?nps固定在spce表面，增強電極的導電能力和可修飾比表面積。并通過s-au鍵將巰基修飾的p1探針固定在au?nps/spce上，并使用bsa封閉非特異性位點。當將cha反應產(chǎn)物dsdna添加到bsa/p1/au?nps/spce表面時，dsdna通過堿基互補與p1雜交錨定在電極表面。添加h3-alp和h4與h1-h2/bsa/p1/aunps/spce一起孵育后，觸發(fā)了hcr，大量的alp被固定在電極表面。agno3溶液中的ag+在alp酶的作用下可發(fā)生氧化還原反應，催化成ag單質(zhì)并沉積在電極表面。電極表面的ag單質(zhì)通過使用電化學工作站的lsv方法進行陽極溶出峰檢測。

63、即本發(fā)明方案采用cha和hcr雙核酸擴增模式，與電化學反應傳感器結(jié)合，可以實現(xiàn)了mir-205-5p的高靈敏度、高特異性檢測，檢測限最低為28fm，為癌癥標志物檢測提供了新的方向。