本技術(shù)總體上涉及特異性地結(jié)合l1-cam蛋白的免疫球蛋白相關(guān)組合物(例如，抗體或其抗原結(jié)合片段)的制備以及所述免疫球蛋白相關(guān)組合物的用途。具體地，本技術(shù)涉及l(fā)1-cam中和抗體的制備以及所述抗體在檢測(cè)和治療l1-cam相關(guān)癌癥中的用途。

背景技術(shù)：

1、下文提供對(duì)本技術(shù)背景的說(shuō)明僅僅是為了幫助理解本技術(shù)，并且不承認(rèn)該說(shuō)明描述或構(gòu)成針對(duì)本技術(shù)的現(xiàn)有技術(shù)。

2、嵌合抗原受體(car)技術(shù)的出現(xiàn)(sadelain?m等人,cancer?discov3:388-98(2013))正在迅速擴(kuò)展抗l1-cam重定向的經(jīng)基因修飾的t細(xì)胞的治療研究，其中使用經(jīng)l1-cam-car修飾的t細(xì)胞進(jìn)行了一些臨床試驗(yàn)：nct00889954(所有l(wèi)1-cam(+)癌癥)、nct01935843(l1-cam(+)實(shí)體瘤)。參見hong?h等人,j?immunother?37:93-104(2014)。雖然t細(xì)胞可以有效地靶向具有低水平l1-cam的腫瘤，但是存在關(guān)于在具有低水平l1-cam表達(dá)的正常組織中潛在的旁觀者毒性的問(wèn)題。

3、除了毒性之外，淋巴細(xì)胞療法的細(xì)胞收獲、加工、儲(chǔ)存、運(yùn)輸和產(chǎn)品釋放調(diào)節(jié)也可能具有挑戰(zhàn)性，尤其是當(dāng)必須對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾時(shí)。盡管輸注數(shù)十億個(gè)這些細(xì)胞，但t細(xì)胞消耗、存活和歸巢是次最優(yōu)的。此外，經(jīng)car修飾的t細(xì)胞對(duì)于免疫抑制性腫瘤微環(huán)境也不例外，其中treg、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和髓樣抑制細(xì)胞協(xié)同工作以規(guī)避經(jīng)car修飾的t細(xì)胞的抗腫瘤特性。此外，經(jīng)car修飾的t細(xì)胞受到經(jīng)典t細(xì)胞所面臨的相同的免疫抑制限制，包括在腫瘤細(xì)胞上ctla4被b7銜接或pd-1被pd-l1(b7-h1)銜接后的無(wú)反應(yīng)性。因此，用于治療癌癥的經(jīng)car修飾的t細(xì)胞療法的臨床上有效的替代方案是必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一個(gè)方面，本公開文本提供了包含重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(vh)和輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域(vl)的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中(a)所述vh包含gytftsywmq的vh-cdr1序列(seq?id?no:53)、einpsngrtnynemfks的vh-cdr2序列(seq?id?no:54)和ydgyyamdy的vh-cdr3序列(seq?id?no:55)；和/或(b)所述vl包含kssqsllyssnqknyla的vl-cdr1序列(seq?id?no:56)、wastres的vl-cdr2序列(seq?id?no:57)和qqyhsypft的vl-cdr3序列(seq?id?no:58)。在所述抗體或抗原結(jié)合片段的一些實(shí)施方案中，所述vh包含seq?idno:1的氨基酸序列，并且所述vl包含seq?id?no:3的氨基酸序列。另外地或可替代地，所述抗體可以進(jìn)一步包含選自igg1、igg2、igg3、igg4、iga1、iga2、igm、igd和ige的同種型的fc結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含含有選自n297a和k322a的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的igg1恒定區(qū)。另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含含有s228p突變的igg4恒定區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段選自fab、f(ab’)2、fab’、scfv和fv。在一些實(shí)施方案中，所述抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或雙特異性抗體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段與l1-cam蛋白的表位結(jié)合，所述表位包含l1-cam的第2ig樣結(jié)構(gòu)域(seq?id?no:74)的至少五至八個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，所述表位是構(gòu)象表位。

2、在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種抗體，所述抗體包含seq?id?no:9、seq?idno:10、seq?id?no:17、seq?id?no:18、seq?id?no:26、seq?id?no:30、seq?id?no:42、seq?idno:46、seq?id?no:49、seq?id?no:51的重鏈(hc)氨基酸序列或其具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代的變體，和/或seq?id?no:13、seq?id?no:14、seq?id?no:21、seq?id?no:22、seq?idno:25、seq?id?no:29、seq?id?no:41、seq?id?no:45、seq?id?no:50、seq?id?no:52的輕鏈(lc)氨基酸序列或其具有一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代的變體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體包含選自以下的hc氨基酸序列和lc氨基酸序列：seq?id?no:9和seq?id?no:13(hue71h1/l1)；seq?id?no:9和seq?id?no:14(hue71?h1/l2)；seq?id?no:10和seq?id?no:13(hue71h2/l1)；seq?id?no:10和seq?id?no:14(hue71?h2/l2)；seq?id?no:17和seq?id?no:21(hue72?h1/l1)；seq?id?no:17和seq?id?no:22(hue72h1/l2)；seq?id?no:18和seq?idno:21(hue72?h2/l1)；seq?id?no:18和seq?id?no:22(hue72?h2/l2)；seq?id?no:26和seqid?no:25(che71igg1)；seq?id?no:30和seq?id?no:29(che72?igg1)；seq?id?no:42和seqid?no:41(che71igg4)；seq?id?no:46和seq?id?no:45(hue71igg4)；seq?id?no:49和seqid?no:50(hue71?bsab)；和seq?id?no:51和seq?id?no:52(hue72?bsab)。

3、在一個(gè)方面，本公開文本提供了一種抗體，所述抗體包含(a)與seq?id?no:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一個(gè)中存在的輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的輕鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列；和/或(b)與seq?id?no:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一個(gè)中存在的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的重鏈免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域序列。

4、在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種抗體，所述抗體包含(a)與seq?id?no:13、14、21、22、25、29、41、45、50或52中的任何一個(gè)中存在的lc序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的lc序列；和/或(b)與seq?id?no:9、10、17、18、26、30、42、46、49和51中的任何一個(gè)中存在的hc序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％相同的hc序列。

5、在上述實(shí)施方案中的任何一個(gè)中，所述抗體是嵌合抗體、人源化抗體或雙特異性抗體。另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，所述抗體包含含有選自n297a和k322a的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的igg1恒定區(qū)。在某些實(shí)施方案中，本技術(shù)的抗體包含含有s228p突變的igg4恒定區(qū)。在上述實(shí)施方案中的任何一個(gè)中，所述抗體與l1-cam蛋白的表位結(jié)合，所述表位包含l1-cam的第2ig樣結(jié)構(gòu)域(seq?id?no:74)或l1-cam的第6ig樣結(jié)構(gòu)域(seq?id?no:75)的至少五至八個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，所述表位是構(gòu)象表位。另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，本技術(shù)的抗體缺乏α-1,6-巖藻糖修飾。

6、在一個(gè)方面，本公開文本提供了編碼本文所述的任何抗體的重組核酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述重組核酸序列選自：seq?id?no:11、12、15、16、19、20、23、24、27、28、31、32、43、44、47和48。

7、在另一個(gè)方面，本公開文本提供了包含本文公開的任何重組核酸序列的宿主細(xì)胞或載體。

8、在一個(gè)方面，本公開文本提供了一種組合物，所述組合物包含本技術(shù)的抗體或抗原結(jié)合片段和藥學(xué)上可接受的載體，其中所述抗體或抗原結(jié)合片段任選地與選自以下的藥劑綴合：同位素、染料、色原(chromagen)、造影劑、藥物、毒素、細(xì)胞因子、酶、酶抑制劑、激素、激素拮抗劑、生長(zhǎng)因子、放射性核素、金屬、脂質(zhì)體、納米顆粒、rna、dna或其任何組合。

9、在本技術(shù)的雙特異性抗體的一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體與t細(xì)胞、b細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、漿細(xì)胞或肥大細(xì)胞結(jié)合。另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，所述雙特異性抗體與cd3、cd4、cd8、cd20、cd19、cd21、cd23、cd46、cd80、hla-dr、cd74、cd22、cd14、cd15、cd16、cd123、tcrγ/δ、nkp46、kir或小分子dota半抗原結(jié)合。所述小分子dota半抗原可以選自dota、dota-bn、dota-去鐵胺、dota-phe-lys(hsg)-d-tyr-lys(hsg)-nh2?、ac-lys(hsg)d-tyr-lys(hsg)-lys(tscg-cys)-nh2?、dota-d-asp-d-lys(hsg)-d-asp-d-lys(hsg)-nh2?；dota-d-glu-d-lys(hsg)-d-glu-d-lys(hsg)-nh2?、dota-d-tyr-d-lys(hsg)-d-glu-d-lys(hsg)-nh2?、dota-d-ala-d-lys(hsg)-d-glu-d-lys(hsg)-nh2?、dota-d-phe-d-lys(hsg)-d-tyr-d-lys(hsg)-nh2?、ac-d-phe-d-lys(dota)-d-tyr-d-lys(dota)-nh2?、ac-d-phe-d-lys(dtpa)-d-tyr-d-lys(dtpa)-nh2?、ac-d-phe-d-lys(bz-dtpa)-d-tyr-d-lys(bz-dtpa)-nh2?、ac-d-lys(hsg)-d-tyr-d-lys(hsg)-d-lys(tscg-cys)-nh2?、dota-d-phe-d-lys(hsg)-d-tyr-d-lys(hsg)-d-lys(tscg-cys)-nh2?、(tscg-cys)-d-phe-d-lys(hsg)-d-tyr-d-lys(hsg)-d-lys(dota)-nh2?、tscg-d-cys-d-glu-d-lys(hsg)-d-glu-d-lys(hsg)-nh2?、(tscg-cys)-d-glu-d-lys(hsg)-d-glu-d-lys(hsg)-nh2?、ac-d-cys-d-lys(dota)-d-tyr-d-ala-d-lys(dota)-d-cys-nh2?、ac-d-cys-d-lys(dtpa)-d-tyr-d-lys(dtpa)-nh2?、ac-d-lys(dtpa)-d-tyr-d-lys(dtpa)-d-lys(tscg-cys)-nh2?和ac-d-lys(dota)-d-tyr-d-lys(dota)-d-lys(tscg-cys)-nh2。

10、在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種治療有需要的受試者中的l1-cam相關(guān)癌癥的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的本文公開的任何一種抗體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體包含選自以下的hc氨基酸序列和lc氨基酸序列：(i)seq?id?no:9和seqid?no:13(hue71?h1/l1)；(ii)seq?id?no:9和seq?id?no:14(hue71?h1/l2)；(iii)seq?idno:10和seq?id?no:13(hue71?h2/l1)；(iv)seq?id?no:10和seq?id?no:14(hue71

11、h2/l2)；(v)seq?id?no:17和seq?id?no:21(hue72?h1/l1)；(vi)seq?id?no:17和seq?id?no:22(hue72?h1/l2)；(vii)seq?id?no:18和seq?id?no:21(hue72?h2/l1)；(viii)seq?id?no:18和seq?id?no:22(hue72?h2/l2)；(ix)seq?id?no:26和seq?id?no:25(che71igg1)；(x)seq?id?no:30和seq?id?no:29(che72?igg1)；(xi)seq?id?no:42和seqid?no:41(che71igg4)；(xii)seq?id?no:46和seq?id?no:45(hue71igg4)；(xiii)seq?idno:49和seq?id?no:50(hue71?bsab)；和(xiv)seq?id?no:51和seq?id?no:52(hue72bsab)，其中所述抗體與l1-cam特異性地結(jié)合并中和l1-cam活性。

12、在一些實(shí)施方案中，所述l1-cam相關(guān)癌癥是白血病、尤文氏肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、骨肉瘤、多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮癌、三陰性乳腺癌、黑色素瘤、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤、間皮瘤、小細(xì)胞肺癌(sclc)、非小細(xì)胞肺癌、nsclc、胰腺導(dǎo)管癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌、胃癌、膽管癌、類癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、胃腸道間質(zhì)瘤(gist)、嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺神經(jīng)外胚層癌癥、胰腺腺癌、結(jié)直腸癌、腎細(xì)胞癌、腫瘤血管、軟骨肉瘤、食管腺癌、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、室管膜瘤、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌、腎上腺腺瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、卵巢顆粒細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤(pnet)、上皮樣肉瘤、鼻腔神經(jīng)膠質(zhì)瘤、髓母細(xì)胞瘤、毛細(xì)血管瘤、卡波西肉瘤、橫紋肌肉瘤、頜下唾液腺癌或頭頸部鱗狀細(xì)胞癌。

13、另外地或可替代地，在所述方法的一些實(shí)施方案中，將所述抗體與另外的治療劑分開地、順序地或同時(shí)給予至所述受試者。另外的治療劑的例子包括以下中的一種或多種：烷基化劑、鉑劑、紫杉烷、長(zhǎng)春花劑、抗雌激素藥物、芳香化酶抑制劑、卵巢抑制劑、vegf/vegfr抑制劑、egf/egfr抑制劑、parp抑制劑、抑制細(xì)胞的生物堿、細(xì)胞毒性抗生素、抗代謝物、內(nèi)分泌/激素劑、二膦酸鹽治療劑。

14、在另一個(gè)方面，本公開文本提供了一種用于在體內(nèi)檢測(cè)受試者中的腫瘤的方法，所述方法包括(a)向所述受試者給予有效量的本技術(shù)的抗體，其中所述抗體被配置為定位于表達(dá)l1-cam的腫瘤，并用放射性同位素標(biāo)記；以及(b)通過(guò)檢測(cè)由所述抗體發(fā)射的高于參考值的放射性水平來(lái)檢測(cè)所述受試者中腫瘤的存在。在一些實(shí)施方案中，所述受試者被診斷患有或懷疑患有癌癥。可以使用正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)檢測(cè)由所述抗體發(fā)射的放射性水平。

15、另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括向所述受試者給予有效量的免疫綴合物，所述免疫綴合物包含與放射性核素綴合的本技術(shù)的抗體。在一些實(shí)施方案中，所述放射性核素是發(fā)射α粒子的同位素、發(fā)射β粒子的同位素、俄歇(auger)發(fā)射體或其任何組合。發(fā)射β粒子的同位素的例子包括86y、90y、89sr、165dy、186re、188re、177lu和67cu。在所述方法的一些實(shí)施方案中，正常組織中非特異性fcr依賴性結(jié)合消除或減少(例如，經(jīng)由fc區(qū)中的n297a突變，其導(dǎo)致去糖基化)。

16、本文還公開了用于檢測(cè)和/或治療l1-cam相關(guān)癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含至少一種本技術(shù)的免疫球蛋白相關(guān)組合物(例如，本文所述的任何抗體或抗原結(jié)合片段)或其功能性變體(例如，取代變體)。在某些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白相關(guān)組合物與一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種可檢測(cè)標(biāo)記包括放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或發(fā)色標(biāo)記。

17、另外地或可替代地，在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒進(jìn)一步包含與本文所述的抗l1-cam免疫球蛋白相關(guān)組合物特異性地結(jié)合的二抗。在一些實(shí)施方案中，所述二抗與選自放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記或發(fā)色標(biāo)記的至少一種可檢測(cè)標(biāo)記偶聯(lián)。