本發(fā)明涉及新穎蛋白孔及其在分析物檢測(cè)和表征中的用途。本發(fā)明還涉及一種跨膜孔復(fù)合物和用于產(chǎn)生所述孔復(fù)合物的方法，及其在分子感測(cè)和核酸測(cè)序應(yīng)用中的用途。

背景技術(shù)：

1、納米孔感測(cè)是一種分析物檢測(cè)和表征的方法，該方法依賴于觀測(cè)分析物分子與離子傳導(dǎo)通道之間的單個(gè)結(jié)合或相互作用事件。通過(guò)將單個(gè)納米尺寸的孔放置在電絕緣膜中，并在分析物分子的存在下測(cè)量通過(guò)該孔的電壓驅(qū)動(dòng)離子電流，可以產(chǎn)生納米孔感測(cè)器。納米孔內(nèi)部或附近的分析物的存在會(huì)改變通過(guò)該孔的離子流，導(dǎo)致在通道上測(cè)量到改變的離子或電流。分析物的特性通過(guò)其獨(dú)特的電流特征來(lái)揭示，特別是通過(guò)電流阻斷的持續(xù)時(shí)間和程度以及在分析物與孔相互作用期間電流水平的變化來(lái)揭示。分析物可以是有機(jī)和無(wú)機(jī)小分子，以及各種生物或合成大分子和聚合物，包括多核苷酸、多肽和多糖。納米孔感測(cè)可以揭示所感測(cè)的分析物的特性并進(jìn)行所感測(cè)的分析物的單分子計(jì)數(shù)，但是也可以提供有關(guān)以下的信息：分析物組成，諸如核苷酸、氨基酸或聚糖序列，以及堿基、氨基酸或聚糖修飾的存在，諸如甲基化和?；⒘姿峄?、羥基化、氧化、還原、糖基化、脫羧、脫氨基等。納米孔感測(cè)具有實(shí)現(xiàn)快速且低成本的多核苷酸測(cè)序的潛力，提供數(shù)十個(gè)至數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基長(zhǎng)度的多核苷酸的單分子序列讀段。

2、使用納米孔感測(cè)進(jìn)行聚合物表征的其中兩個(gè)基本組成部分是：(1)控制聚合物通過(guò)該孔的運(yùn)動(dòng)；(2)區(qū)別聚合物移動(dòng)通過(guò)該孔時(shí)的組成構(gòu)建塊(building?block)。在納米孔感測(cè)期間，孔最窄的部分形成讀取頭，就電流特征而言，納米孔最有區(qū)別的部分隨正通過(guò)的分析物而變化。csgg經(jīng)鑒定為來(lái)自大腸桿菌(escherichia?coli)的無(wú)門控、非選擇性蛋白質(zhì)分泌通道(goyal等人，2014)，并已用作檢測(cè)和表征分析物的納米孔。還公開(kāi)了在這種情況下改善孔的性質(zhì)的野生型csgg孔的突變(wo2016/034591、wo2017/149316、wo2017/149317和wo2017/149318，pct/gb2018/051191，全部通過(guò)引用并入本文)。

3、對(duì)于是多核苷酸的分析物，核苷酸的區(qū)別是經(jīng)由通過(guò)這種突變孔的通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，但已證實(shí)電流特征具有序列依賴性，并且多個(gè)核苷酸有助于觀測(cè)到電流，使得通道收縮段的高度以及表面與分析物相互作用的程度會(huì)影響觀測(cè)到的電流與多核苷酸序列之間的關(guān)系。雖然通過(guò)csgg孔的突變改善了核苷酸區(qū)別的電流范圍，但是如果可以進(jìn)一步改善核苷酸之間的電流差異，則測(cè)序系統(tǒng)將具有更高的性能。因此，需要鑒定改善納米孔感測(cè)特性的新穎方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本公開(kāi)涉及經(jīng)修飾的csgf肽，尤其是截短的csgf片段，其結(jié)合csgg孔并由此在csgg孔內(nèi)引入另一附加的通道或孔收縮段。本發(fā)明的其他方面還涉及分離的跨膜孔復(fù)合物，以及所述csgg:csgf復(fù)合物和經(jīng)修飾的csgf肽或片段在具有兩個(gè)連續(xù)讀取頭的納米孔感測(cè)平臺(tái)中的用途。

2、本發(fā)明的第一方面涉及包含csgg孔和csgf肽的孔。一方面，csgf肽包含csgg結(jié)合區(qū)和在孔中形成收縮段的區(qū)。一方面，csgf肽是缺少csgf的c端頭部結(jié)構(gòu)域的截短的csgf肽。另一方面，csgf肽是缺少csgf的c端頭部結(jié)構(gòu)域和一部分頸部結(jié)構(gòu)域的截短的csgf肽。另一方面，csgf肽是缺少csgf的c端頭部結(jié)構(gòu)域和頸部結(jié)構(gòu)域的截短的csgf肽?？自诒疚闹幸卜Q為孔復(fù)合物和分離的孔復(fù)合物。分離的孔復(fù)合物包含csgg孔或其同源物或突變體，以及經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體，尤其是截短的csgf片段或其同源物或突變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體位于csgg孔或其同源物或突變體的內(nèi)腔中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述分離的孔復(fù)合物具有兩個(gè)或更多個(gè)通道收縮段，一個(gè)通道收縮段由csgg孔定位或提供，由其收縮環(huán)形成，另一個(gè)附加通道收縮段或讀取頭由經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體引入。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述csgg孔或csgg樣孔不是野生型孔，它是突變的csgg孔，在特定的實(shí)施方案中，例如在所述通道收縮環(huán)中存在突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體的分離的孔復(fù)合物具有直徑在0.5nm至2.0nm范圍內(nèi)的csgf通道收縮段。在一個(gè)實(shí)施方案中，孔復(fù)合物包含：(i)csgg孔，其包含第一開(kāi)口、包含β桶的中間區(qū)段、第二開(kāi)口以及從第一開(kāi)口延伸通過(guò)中間區(qū)段到達(dá)第二開(kāi)口的內(nèi)腔，其中所述中間區(qū)段的內(nèi)腔表面限定csgg收縮段；和(ii)多個(gè)經(jīng)修飾的csgf肽，每個(gè)經(jīng)修飾的csgf肽具有csgf收縮區(qū)和csgg結(jié)合區(qū)(在本文中也稱為csgf的csgg結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合區(qū))，其中所述經(jīng)修飾的csgf肽在所述csgg孔的β桶內(nèi)形成csgf收縮段，并且其中所述csgg收縮段和所述csgf收縮段在所述csgg孔的β桶內(nèi)同軸間隔開(kāi)。csgg孔的內(nèi)腔表面可包含csgg單體的限定csgg收縮段的一個(gè)或多個(gè)環(huán)區(qū)。csgf收縮區(qū)和csgf結(jié)合區(qū)通常與csgf成熟肽的n端部分相對(duì)應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，孔復(fù)合物不包括csga、csgb和csge。

3、在第二方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體，其中所述蛋白質(zhì)或肽通過(guò)部分蛋白質(zhì)的截短或缺失得以修飾，產(chǎn)生seq?id?no:6的csgf片段或其同源物或突變體。一個(gè)實(shí)施方案涉及一種經(jīng)修飾或截短的csgf肽，或csgf同源物或突變體的經(jīng)修飾肽，所述經(jīng)修飾肽包含seq?id?no:39或seq?id?no:40，或其同源物或突變體，可替代地，所述經(jīng)修飾肽包含seq?id?no:15，或其同源物或突變體，可替代地包含seq?id?no:54，或seq?id?no:55，或其同源物或突變體。另一個(gè)實(shí)施方案公開(kāi)了一種經(jīng)修飾的csgf肽，其中在包含seq?id?no:15的區(qū)中的一個(gè)或多個(gè)位置被修飾，并且其中所述突變需要在與包含seq?id?no:15的區(qū)相對(duì)應(yīng)的肽片段中保持與seq?id?no:15至少35％的氨基酸同一性。

4、一個(gè)實(shí)施方案涉及一種包含csgg孔和經(jīng)修飾的csgf肽的孔，其中所述經(jīng)修飾的csgf肽與csgg結(jié)合并在所述孔中形成收縮段

5、一個(gè)實(shí)施方案涉及一種編碼根據(jù)本發(fā)明第二方面的所述經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體的多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含csgg孔和經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體的分離的孔復(fù)合物的特征在于，所述經(jīng)修飾的csgf肽是由本發(fā)明第二方面中公開(kāi)的肽提供的肽。

6、另一個(gè)實(shí)施方案涉及分離的孔復(fù)合物，其中經(jīng)修飾的csgf肽和csgg孔或所述孔的單體，或其同源物或突變體共價(jià)偶聯(lián)。甚至更具體地，所述偶聯(lián)是在與seq?id?no:3或其同源物的132、133、136、138、140、142、144、145、147、149、151、153、155、183、185、187、189、191、201、203、205、207或209相對(duì)應(yīng)的位置，通過(guò)半胱氨酸殘基或通過(guò)csgg單體中的非天然反應(yīng)性或光反應(yīng)性氨基酸進(jìn)行的。

7、一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案涉及一種分離的跨膜孔復(fù)合物或膜組合物，其包含本發(fā)明的分離的孔復(fù)合物和膜的組分。具體地，所述跨膜孔復(fù)合物或膜組合物由本發(fā)明的分離的孔復(fù)合物以及膜或絕緣層的組分組成。

8、一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于產(chǎn)生如本文所公開(kāi)的孔的方法，該方法包括使如本文所公開(kāi)的一個(gè)或多個(gè)csgg單體和如本文所公開(kāi)的csgf肽在宿主細(xì)胞中共表達(dá)，從而允許在細(xì)胞中形成跨膜孔復(fù)合物。csgf肽可通過(guò)裂解經(jīng)修飾的csgf肽或蛋白質(zhì)而產(chǎn)生，所述經(jīng)修飾的csgf肽或蛋白質(zhì)在氨基酸序列的合適位置處包含酶裂解位點(diǎn)。

9、一個(gè)實(shí)施方案涉及一種用于產(chǎn)生如本文所公開(kāi)的孔的方法，該方法包括使一個(gè)或多個(gè)純化csgg單體與一個(gè)或多個(gè)純化的經(jīng)修飾的csgf肽接觸，從而允許在體外形成孔。經(jīng)修飾的csgf肽可以是在氨基酸序列的合適位置處包含酶裂解位點(diǎn)的肽，該肽在孔形成之前或之后被裂解。

10、本發(fā)明的第三方面涉及一種用于產(chǎn)生所述跨膜孔復(fù)合物的方法，其中所述孔是由csgg孔或其同源物或突變體和經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體形成的分離的復(fù)合物，該方法包括以下步驟：使csgg?seq?id?no:2或其同源物或突變體，以及經(jīng)修飾或截短的csgf(包含seq?id?no:5的片段)或其同源物或突變體在合適的宿主中共表達(dá)，從而允許在體內(nèi)形成孔復(fù)合物。在具體實(shí)施方案中，所述經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體包含seqid?no:12或seq?id?no:14，或其同源物或突變體?？商娲?，用于產(chǎn)生分離的孔復(fù)合物的方法包括以下步驟：使seq?id?no:3的csgg單體或其同源物或突變體與經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體接觸，以便體外重構(gòu)孔復(fù)合物。在特定實(shí)施方案中，所述方法的經(jīng)修飾的csgf肽包含seq?id?no:15或seq?id?no:16，或其同源物或突變體。

11、本發(fā)明的另一方面涉及一種用于確定靶分析物的存在、不存在或一個(gè)或多個(gè)特征的方法，所述方法包括以下步驟：

12、(i)使靶分析物與所述分離的孔復(fù)合物或跨膜孔復(fù)合物接觸，使得靶分析物移動(dòng)到孔通道中；并且

13、(ii)在分析物移動(dòng)通過(guò)孔通道時(shí)進(jìn)行一項(xiàng)或多項(xiàng)測(cè)量，從而確定所述分析物的存在、不存在或一個(gè)或多個(gè)特征。

14、在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分析物是多核苷酸。具體而言，使用多核苷酸作為分析物的所述方法可替代地包括確定一個(gè)或多個(gè)選自以下的特征：(i)多核苷酸的長(zhǎng)度，(ii)多核苷酸的同一性，(iii)多核苷酸的序列，(iv)多核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及(v)多核苷酸是否被修飾。

15、在另一個(gè)實(shí)施方案中，分析物是蛋白質(zhì)或肽，并且在其他實(shí)施方案中，所述分析物是多糖或小的有機(jī)或無(wú)機(jī)化合物，例如但不限于藥理活性化合物、有毒化合物和污染物。

16、在另一個(gè)實(shí)施方案中，描述了一種使用分離的跨膜孔復(fù)合物表征多核苷酸或(多)肽的方法，其中所述孔復(fù)合物是分離的復(fù)合物，其包含csgg孔或其同源物或突變體以及經(jīng)修飾的csgf肽或其同源物或突變體。具體而言，所述csgg孔或其同源物或突變體，包含六至十個(gè)形成csgg孔通道的csgg單體。

17、本發(fā)明的另一方面公開(kāi)了根據(jù)本發(fā)明前述方面的所述分離的孔復(fù)合物或跨膜孔復(fù)合物用于確定靶分析物的存在、不存在或一個(gè)或多個(gè)特征的用途。此外，本發(fā)明還涉及用于表征靶分析物的試劑盒，其包含(a)所述分離的孔復(fù)合物和(b)膜的組分。