本發(fā)明涉及水解酶，具體為一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法。

背景技術(shù)：

1、麥芽糖是由兩分子d-葡萄糖通過α-1,4-苷鍵相連形成的還原性二糖；?它可以通過開鏈和環(huán)狀結(jié)構(gòu)式相互轉(zhuǎn)變，?產(chǎn)生變旋現(xiàn)象；其在酸性條件下可以完全水解成兩分子d-葡萄糖。

2、乳糖是由一分子d-半乳糖和一分子葡萄糖通過β-1,4-苷鍵縮合形成的非還原性二糖。?乳糖經(jīng)酸或苦杏仁酶水解，?可以得到一分子d-半乳糖和一分子葡萄糖。?乳糖是由β-d-半乳糖的半縮醛羥基與d-葡萄糖c4上的醇羥基脫水形成的。

3、纖維二糖可以水解成兩分子d-葡萄糖，?但不同于麥芽糖的是，?水解纖維二糖必須用葡萄糖甘酶（?苦杏仁酶）?，?表明兩分子葡萄糖間是以β-1,4-鍵相連。?纖維二糖分子有一個半縮醛羥基，?能還原斐林試劑，?在水溶液中有變旋光的現(xiàn)象。?它不能為麥芽糖酶水解，?可為苦杏仁酶水解。?

4、綜上所述，?麥芽糖、?乳糖和纖維二糖雖然都是二糖，?但它們的水解產(chǎn)物各不相同，水解所需的酶也各不相同。目前，多采用不同的水解酶對麥芽糖、乳糖、纖維二糖進行水解，基于此，本?發(fā)明提供一種酶，從糞腸球菌ctb中得到一種二糖水解酶，既可實現(xiàn)對麥芽糖的水解，又可實現(xiàn)對?乳糖和纖維二糖的水解。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，得到的二糖水解酶gena可實現(xiàn)對麥芽糖、乳糖、纖維二糖的水解。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

3、一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，包括：

4、s1：通過pcr從糞腸球菌ctb的基因組中擴增gena基因，并將pcr擴增產(chǎn)物通過tev/lic系統(tǒng)將gena基因克隆到pet30質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒；

5、擴增時，上游引物gena-f：

6、tacttccaatccaatgccatatgtcaattttgaaaaatga；

7、下游引物gena-r：

8、ttatccacttccaatgctatttataattcttctcc；

9、s2：將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，并使gena基因在感受態(tài)大腸桿菌中過量表達；

10、s3：對過量表達gena基因的大腸桿菌進行裂解、篩選和純化，即可得到二糖水解酶gena。

11、進一步地，步驟s2中感受態(tài)大腸桿菌為bl21-codon?plus（de3）細胞。

12、進一步地，步驟s2具體過程為：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，將重組大腸桿菌用含有34?μg/ml卡那霉素的lb-瓊脂板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子接種到含有卡那霉素的5?ml?lb培養(yǎng)基中，310k溫度下攪拌培養(yǎng)12h；培養(yǎng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的1?l?lb培養(yǎng)基中，在310k下攪拌培養(yǎng)，當菌體濃度od600達到0.6-0.8時，加入100?μm異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷，于289?k溫度下孵育16-18h，即可得到過量表達gena蛋白的大腸桿菌。

13、進一步地，步驟s3中裂解篩選的方法為：將過量表達gena基因的大腸桿菌在293k下以5000g的速度離心15min，并在裂解緩沖液中重懸；將重懸液在冰上以2秒脈沖和5秒暫停的方式超聲裂解15min，然后在277k下以30000g離心40min，將上清液加載到ni-nta樹脂柱上，用洗滌緩沖液洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用洗脫緩沖液洗脫得到gena蛋白質(zhì)；

14、洗滌緩沖液包括25mm?tris-hcl、500mm?nacl、50mm?咪唑，ph為8.0；

15、洗脫緩沖液包括25mm?tris-hcl、500mm?nacl、100mm?咪唑，ph為8.0。

16、進一步地，步驟s3中用離子交換色譜hitrap?q?hp和凝膠過濾色譜hiload?16/60superdex?200?pg進行純化。

17、進一步地，用離子交換色譜純化的過程為：用amicon?ultra超濾離心管將gena蛋白質(zhì)濃縮至2ml，然后稀釋至含有25mm?tris-hcl、ph為8.0的10ml緩沖液中，隨后將稀釋液加入hitrap?q?hp色譜柱中，通過線性nacl梯度洗脫，對應(yīng)的nacl梯度為0-1?m，收集gena蛋白的峰值分餾物；

18、用凝膠過濾色譜純化的過程為：將gena蛋白的峰值分餾物濃縮至2?ml，然后加載到hiload?16/60?superdex?200?pg柱上進行純化，并置換到含有25?mm?tris-hcl、200?mmnacl、1?mm?dtt、ph?8.0的緩沖液中；對應(yīng)gena蛋白的尖銳峰值被匯集并使用amicon?ultra超濾離心管濃縮至10?mg/ml，即得重組gena。

19、上述任一項所述的制備方法制備的二糖水解酶gena在水解麥芽糖、乳糖、纖維二糖上的應(yīng)用；水解麥芽糖時的溫度為40℃，ph?值為7.5；水解乳糖時的溫度為50℃，ph值為8.5；水解纖維二糖時的溫度為60℃，ph?值為8.0-9.0。

20、進一步地，水解麥芽糖時，ni2+、mn2+、al3+對水解有抑制作用，而mg2+、fe3+對水解有激活作用；

21、水解乳糖時，ni2+、mn2+對水解有抑制作用，而mg2+、ca2+對水解有激活作用；

22、水解纖維二糖時，mn2+和ni2+對水解有抑制作用，mg2+對水解有激活作用。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

24、（1）本發(fā)明通過將gena基因擴增并克隆到質(zhì)粒載體中，得到重組質(zhì)粒，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中，對過表達gena基因的大腸桿菌裂解、篩選和純化，即可得到二糖水解酶gena，得到的酶不僅能水解麥芽糖、還能水解乳糖和纖維二糖，為麥芽糖、乳糖、纖維二糖的水解提供了一種新的選擇。

25、（2）本發(fā)明還提供了一種二糖水解酶gena的應(yīng)用，并研究了該酶水解時的最佳溫度、ph值、以及金屬離子的抑制或激活作用，為二糖水解酶gena在使用過程中對反應(yīng)速率的控制提供了理論依據(jù)，使得本發(fā)明制備得到的二糖水解酶gena可廣泛應(yīng)用于各行各業(yè)，如食品和飲料行業(yè)、乳制品加工、制藥和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用、生物技術(shù)、研究和診斷、釀酒行業(yè)、功能性食品開發(fā)等等。

技術(shù)特征：

1.一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，包括：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，步驟s2中感受態(tài)大腸桿菌為bl21-codon?plus（de3）細胞。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，步驟s2具體過程為：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中得到重組大腸桿菌，將重組大腸桿菌用含有34?μg/ml卡那霉素的lb-瓊脂板篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子接種到含有卡那霉素的5?ml?lb培養(yǎng)基中，310?k溫度下攪拌培養(yǎng)12h；培養(yǎng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的1?l?lb培養(yǎng)基中，在310?k下攪拌培養(yǎng)，當菌體濃度od600達到0.6-0.8時，加入100?μm異丙基β-d-1-硫代半乳糖苷，于289?k溫度下孵育16-18h，即可得到過量表達gena蛋白的大腸桿菌。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，步驟s3中裂解篩選的方法為：將過量表達gena基因的大腸桿菌在293k下以5000g的速度離心15min，并在裂解緩沖液中重懸；將重懸液在冰上以2秒脈沖和5秒暫停的方式超聲裂解15min，然后在277k下以30000g離心40min，將上清液加載到ni-nta樹脂柱上，用洗滌緩沖液洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)后，用洗脫緩沖液洗脫得到gena蛋白質(zhì)；

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，步驟s3中用離子交換色譜hitrap?q?hp和凝膠過濾色譜hiload?16/60?superdex200?pg進行純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種來源于糞腸球菌ctb的二糖水解酶gena的制備方法，其特征在于，用離子交換色譜純化的過程為：用amicon?ultra超濾離心管將gena蛋白質(zhì)濃縮至2ml，然后稀釋至含有25mm?tris-hcl、ph為8.0的10ml緩沖液中，隨后將稀釋液加入hitrapq?hp色譜柱中，通過線性nacl梯度洗脫，對應(yīng)的nacl梯度為0-1?m，收集gena蛋白的峰值分餾物；

7.權(quán)利要求1~6任一項所述的制備方法制備的二糖水解酶gena在水解麥芽糖、乳糖、纖維二糖上的應(yīng)用，其特征在于，水解麥芽糖時的溫度為40℃，ph?值為7.5；水解乳糖時的溫度為50℃，ph值為8.5；水解纖維二糖時的溫度為60℃，ph?值為8.0-9.0。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的二糖水解酶gena的應(yīng)用，其特征在于，水解麥芽糖時，ni2+、mn2+、al3+對水解有抑制作用，而mg2+、fe3+對水解有激活作用；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種來源于糞腸球菌CTB的二糖水解酶GenA的制備方法，涉及水解酶技術(shù)領(lǐng)域。包括：S1：通過PCR從糞腸球菌CTB的基因組中擴增GenA基因，并將PCR擴增產(chǎn)物通過TEV/LiC系統(tǒng)將GenA基因克隆到Pet30質(zhì)粒載體上，得到重組質(zhì)粒；S2：將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中；S3：對過量表達GenA基因的大腸桿菌進行裂解、篩選和純化，即可得到二糖水解酶GenA。本發(fā)明通過PCR擴增、克隆、裂解、篩選和純化等步驟得到的酶不僅能水解麥芽糖、還能水解乳糖和纖維二糖，為麥芽糖、乳糖、纖維二糖的水解提供了一種新的選擇。

技術(shù)研發(fā)人員：劉占英,韓曉東
受保護的技術(shù)使用者：內(nèi)蒙古工業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6