本技術(shù)涉及原糧病原物檢測，特別是涉及一種用于原糧檢疫性病原物檢測的微流控芯片。

背景技術(shù)：

1、原糧是指大豆、小麥、玉米等未經(jīng)加工的糧食或農(nóng)作物的統(tǒng)稱。原糧病原物包括真菌、細菌、病毒、卵菌等，是嚴重影響原糧生產(chǎn)和貿(mào)易的重要因素。在眾多的原糧病原物中，檢疫性病原物的危害性尤為嚴重；其中包括大豆北方莖潰瘍病菌(diaporthe?phaseolorumvar.caulivora)、大豆莖褐腐病菌(cadophora?gregata)、北美大豆猝死綜合癥病菌(fusarium?virguliforme)、菜豆細菌萎蔫病菌(curtobacterium?flaccumfacienspv.flaccumfaciens)、小麥印度腥黑穗病菌(tilletia?indica)、黑麥草腥黑粉菌(tilletia?walkeri)、小麥線條花葉病毒(wsmv)、玉米細菌性枯萎病菌(pantoeastewartii?subsp.stewartii)、玉米內(nèi)州萎蔫病菌(clavibacter?michiganensissubsp.nebraskensis)、玉米褪綠斑駁病毒(mcmv)、番茄潰瘍病菌(clavibactermichiganensis?subsp.michiganensis)等。

2、現(xiàn)有的針對原糧檢疫性病原物的檢測方法包括依據(jù)科赫氏法則的傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定檢測方法、血清學檢測方法、常規(guī)pcr檢測方法、等溫擴增檢測方法、實時熒光pcr檢測方法等，這些方法每次檢測只能檢測單一的一種病原物，或者只能實現(xiàn)少數(shù)幾種病原物的同時檢測，效率相對較低。

3、并且，現(xiàn)有的檢測方法都存在不同的缺陷和不足。傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定檢測方法：1、培養(yǎng)耗時長，一般需要培養(yǎng)7～14天；2、工作量大，通常需要配置大量的選擇性培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；3、對于細菌、病毒這類不易鏡檢觀察特征的病原物，難以直接快速、準確得到檢測結(jié)果；4、培養(yǎng)基選擇、實驗室環(huán)境(如ph、溫度等)等因素均會影響微生物生長，并且培養(yǎng)基存在污染風險，這些都會影響鑒定結(jié)果。血清學檢測方法：1、抗血清制備需要的時間較長，經(jīng)常存在假陽性反應(yīng)，而使檢測靈敏度降低；2、在抗體、抗原量較少或質(zhì)量不高時，無法用此方法檢測。常規(guī)pcr檢測方法：1、制膠、跑膠等操作對人體有害；2、操作過程中對pcr管的開蓋易造成氣溶膠污染。等溫擴增方法缺點：1、該檢測方法對引物設(shè)計要求較高；2、該方法極易污染產(chǎn)生假陽性。實時熒光pcr檢測技術(shù)缺點：配制工作液流程繁瑣、耗時長。

4、總之，目前缺乏針對原糧檢疫性病原物的簡單有效的高通量的快速檢測技術(shù)，極大的影響了原糧檢疫性病原物的檢驗檢疫工作。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)的目的是提供一種新的用于原糧檢疫性病原物檢測的微流控芯片。

2、本技術(shù)采用了以下技術(shù)方案：

3、本技術(shù)的一方面公開了一種用于原糧檢疫性病原物檢測的微流控芯片，每塊微流控芯片包括8個檢測通道，每個檢測通道包括48個反應(yīng)區(qū)，48個反應(yīng)區(qū)用于對11種原糧檢疫性病原物進行檢測；11種原糧檢疫性病原物包括大豆北方莖潰瘍病菌、大豆莖褐腐病菌、北美大豆猝死綜合癥病菌、菜豆細菌萎蔫病菌、小麥印度腥黑穗病菌、黑麥草腥黑粉菌、小麥線條花葉病毒、玉米細菌性枯萎病菌、玉米內(nèi)州萎蔫病菌、玉米褪綠斑駁病毒、番茄潰瘍病菌。

4、需要說明的是，本技術(shù)的微流控芯片創(chuàng)造性的將對原糧危害較大的11個檢疫性病原物整合到一塊微流控芯片上，并通過對11種原糧檢疫性病原物的檢測引物和探針進行設(shè)計，使得11種原糧檢疫性病原物能夠在同一塊微流控芯片上同時進行高通量的檢測，提高了原糧檢疫性病原物的檢測效率，對原糧檢疫性病原物的檢驗檢疫工作具有重要意義。

5、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，檢測大豆北方莖潰瘍病菌的反應(yīng)區(qū)中含有大豆北方莖潰瘍病菌特異性檢測引物和探針，檢測大豆莖褐腐病菌的反應(yīng)區(qū)中含有大豆莖褐腐病菌特異性檢測引物和探針，檢測北美大豆猝死綜合癥病菌的反應(yīng)區(qū)中含有北美大豆猝死綜合癥病菌特異性檢測引物和探針，檢測菜豆細菌萎蔫病菌的反應(yīng)區(qū)中含有菜豆細菌萎蔫病菌特異性檢測引物和探針，檢測小麥印度腥黑穗病菌的反應(yīng)區(qū)中含有小麥印度腥黑穗病菌特異性檢測引物和探針，檢測黑麥草腥黑粉菌的反應(yīng)區(qū)中含有黑麥草腥黑粉菌特異性檢測引物和探針，檢測小麥線條花葉病毒的反應(yīng)區(qū)中含有小麥線條花葉病毒特異性檢測引物和探針，檢測玉米細菌性枯萎病菌的反應(yīng)區(qū)中含有玉米細菌性枯萎病菌特異性檢測引物和探針，檢測玉米內(nèi)州萎蔫病菌的反應(yīng)區(qū)中含有玉米內(nèi)州萎蔫病菌特異性檢測引物和探針，檢測玉米褪綠斑駁病毒的反應(yīng)區(qū)中含有玉米褪綠斑駁病毒特異性檢測引物和探針，檢測番茄潰瘍病菌的反應(yīng)區(qū)中含有番茄潰瘍病菌特異性檢測引物和探針。

6、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，大豆北方莖潰瘍病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.1和2所示序列，探針為seq?id?no.3所示序列；大豆莖褐腐病菌特異性上下游引物依序為seq?id?no.4和5所示序列，探針為seq?id?no.6所示序列；北美大豆猝死綜合癥病菌特異性上下游引物依序為seq?id?no.7和8所示序列，探針為seq?id?no.9所示序列；菜豆細菌萎蔫病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.10和11所示序列，探針為seq?id?no.12所示序列；小麥印度腥黑穗病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.13和14所示序列，探針為seq?id?no.15所示序列；黑麥草腥黑粉菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.16和17所示序列，探針為seq?id?no.18所示序列；小麥線條花葉病毒特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.19和20所示序列，探針為seq?id?no.21所示序列；玉米細菌性枯萎病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.22和23所示序列，探針為seq?id?no.24所示序列；玉米內(nèi)州萎蔫病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.25和26所示序列，探針為seq?id?no.27所示序列；玉米褪綠斑駁病毒特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.28和29所示序列，探針為seq?id?no.30所示序列；番茄潰瘍病菌特異性檢測引物和探針的上下游引物依序為seq?id?no.31和32所示序列，探針為seq?idno.33所示序列。

7、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，原糧檢疫性病原物對應(yīng)的特異性檢測引物和探針預(yù)先包埋在相應(yīng)的檢測反應(yīng)區(qū)中。例如，大豆北方莖潰瘍病菌特異性檢測引物和探針，預(yù)先包埋在檢測大豆北方莖潰瘍病菌的反應(yīng)區(qū)中，在進行檢測時，只需要將反應(yīng)液和檢測樣本的混合溶液通入檢測通道中即可。本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，微流控芯片包括8個檢測通道，即可實現(xiàn)8個不同樣本的同時檢測。

8、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，每個反應(yīng)區(qū)的體積為1μl。

9、本技術(shù)另一面公開了本技術(shù)微流控芯片在制備原糧檢疫性病原物檢測試劑盒中的應(yīng)用。

10、本技術(shù)再一面公開了一種原糧檢疫性病原物檢測的試劑盒，其含有本技術(shù)的微流控芯片。

11、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，試劑盒中還含有11種原糧檢疫性病原物的陽性對照和/或陰性對照。

12、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，陽性對照為含有原糧檢疫性病原物檢測片段的質(zhì)粒。

13、本技術(shù)的一種實現(xiàn)方式中，試劑盒中還含有探針法實時熒光定量pcr檢測試劑。

14、需要說明的是，為了使用方便，將本技術(shù)的微流控芯片與配套使用的陽性對照、陰性對照、探針法實時熒光定量pcr檢測試劑等組裝到試劑盒中；可以理解，除了本技術(shù)的微流控芯片以外，其他組分都可以單獨市售購買獲得。

15、本技術(shù)的有益效果在于：

16、本技術(shù)的微流控芯片，檢測效率高，每塊芯片可同時對8個待測樣本進行11種原糧檢疫性病原物檢測，提高了原糧檢疫性病原物的檢測效率，對原糧檢疫性病原物的檢驗檢疫工作具有重要意義。