本發(fā)明屬于天然藥物化學(xué)研究領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、仿刺參(apostichopus?japonicus?selenka)屬棘皮動物門(echinopermata)、海參綱(holothuroidea)、楯手目(aspidochirotida)、刺參科(stichopodidae)、仿刺參屬(apostichopus)海洋生物，是我國傳統(tǒng)的食材與中藥材，是我國北方主要的食用海參品種，是最為名貴的海參品種，被譽為“參中之冠”。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認為，仿刺參具有滋補功效，可以治療經(jīng)血虧損、虛弱勞祛、陽痿夢遺、小便頻數(shù)、腸燥便艱等多種癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)研究表明，仿刺參富含氨基酸、維生素、脂肪酸、常量和微量元素等人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，可以調(diào)節(jié)人體的生長和代謝，增強人體免疫力，促進人腦發(fā)育。仿刺參還含有皂苷、腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂、酸性粘多糖、凝集素等結(jié)構(gòu)新穎的次生代謝產(chǎn)物，這些物質(zhì)具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血、抗輻射等多種生物活性。

2、海參皂苷是仿刺參中重要的活性成分，由苷元和糖鏈通過β-糖苷鍵結(jié)合組成的，大多屬于羊毛甾醇型三萜類寡糖苷。仿刺參中皂苷的糖鏈一般由2-6個單糖組成，單糖一般為：木糖(xyl)、葡萄糖(glc)、喹諾糖(qui)、3-甲基葡萄糖(meglc)等，連接苷元的第一個單糖常為木糖。仿刺參中皂苷的苷元常為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜，按照苷元的結(jié)構(gòu)可以將其分為兩種：海參烷型(holostane-type)和非海參烷型(non-holostane-type)。海參烷型苷元一般含有18(20)-內(nèi)酯環(huán)，而非海參烷型苷元有18(16)-內(nèi)酯環(huán)或無內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。目前仿刺參中報道的海參皂苷共有49種，其中，海參烷型皂苷占絕大多數(shù)，其中，海參烷型皂苷holotoxin?a1、holotoxin?b1、cladoloside?b是仿刺參中3種含量較多的海參皂苷類化合物。仿刺參中的海參皂苷具有抗腫瘤活性、抗氧化活性、抑菌活性、抗凝血活性等多種生物活性。

3、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接研究表明，糖鏈較短的海參次級皂苷相比于糖鏈較長的海參皂苷具有更好的抑癌活性，制備糖鏈較短的海參次級皂苷有助于發(fā)現(xiàn)潛在的活性優(yōu)良的抗癌藥物。皂苷水解的方法主要有酸水解法、堿水解法和酶解法。其中，酸、堿水解的方法條件較為劇烈，容易引起皂苷母核反生改變，而酶解法條件相對溫和，且具有較強的特異性，易于制備目標(biāo)次級皂苷。陳靜蘭等(海參皂苷echinoside?a的酶解及其產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定與溶血毒性[j].食品工業(yè)科技,2018,39(10):95-99,109.)研究了5種商品酶對海參皂苷echinoside?a的酶解作用。結(jié)果表明，果膠酶、果膠酶ultra?sp-l和纖維素酶對echinosidea有酶解效果，淀粉葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶對echinoside?a沒有酶解作用。采用hplc-ms對酶解產(chǎn)物進行分析，推測echinoside?a的酶解產(chǎn)物有兩種，一種二糖基次級海參皂苷和一種單糖基次級海參皂苷。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供了一種酶解仿刺參中海參烷型皂苷制備海參次級皂苷的方法。本發(fā)明的具體內(nèi)容如下。

2、一種海參次級皂苷的制備方法通過如下步驟獲得海參次級皂苷：(1)將海參總皂苷或海參皂苷單體溶于緩沖溶液中超聲溶解，獲得海參皂苷溶液；(2)將酶溶于緩沖溶液中，獲得酶溶液；(3)將海參皂苷溶液與酶溶液混合，進行酶解反應(yīng)，獲得酶解液；(4)將酶解液冷卻、醇沉，上清液回收溶劑，得到海參皂苷酶解產(chǎn)物；(5)將海參皂苷酶解產(chǎn)物進行硅膠柱層析和/或反相柱層析分離和/或制備型高效液相色譜分離純化，得到海參次級皂苷cladoloside?a單體。

3、選用的海參總皂苷為仿刺參總皂苷，選用的海參皂苷單體為海參皂苷holotoxinb1或海參皂苷cladoloside?b。

4、所選用的酶為蝸牛酶。

5、所選用的緩沖溶液為ph?5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液。

6、所選用的醇沉試劑為乙醇。

7、所述的硅膠柱層析流動相為二氯甲烷-甲醇-水混合溶劑，梯度洗脫體積比為13:2.5:0.3-13:3.3:0.3。

8、反相柱層析固定相為ods，流動相為甲醇-水混合溶劑，梯度洗脫體積比為10:1-4:1或丙酮-水混合溶劑，梯度洗脫體積比為12:1-2:1。

9、制備型高效液相色譜流動相為乙腈-水混合溶劑，優(yōu)選體積比為43:57-38:62。

10、所述海參次級皂苷cladoloside?a用于制備抗癌藥物。

11、海參次級皂苷cladoloside?a與醫(yī)學(xué)上可接受的藥用輔料組成藥物。

12、海參次級皂苷cladoloside?a用于制備具有抗癌功能的保健品。

13、海參次級皂苷cladoloside?a與其他輔料制備成保健品。

14、本發(fā)明提供的海參皂苷酶解方法可用于酶解仿刺參及其他海參中的多種皂苷類成分從而獲得多種海參次級皂苷。分子對接模擬結(jié)果提示，海參次級皂苷相較于海參皂苷對三陰性乳腺癌mda-mb-231細胞、肝癌hepg2細胞具有更好的細胞毒作用。

15、本發(fā)明制備的cladoloside?a單體純度可達99％以上，可用于仿刺參及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量控制以及制備抗癌藥物組合物及其他產(chǎn)品。

16、本發(fā)明利用ms和nmr等手段鑒定了分得的酶解產(chǎn)物mj-1為cladoloside?a的化學(xué)結(jié)構(gòu)。mj-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)鑒定過程及相關(guān)數(shù)據(jù)如下：

17、

18、cladoloside?a的結(jié)構(gòu)式

19、化合物mj-1為白色粉末，高分辨質(zhì)譜(hr-esi-ms)給出m/z?1077.5228[m+na]+峰，提示化合物mj-1的分子量為1054.7545，推測其分子式為c53h82o21?；衔飉j-1的13cnmr(c5d5n,150mhz)譜共給出53個碳信號，其中包括30個母核碳信號和23個糖基碳信號。結(jié)合dept?90°譜和dept?135°譜可知，低場區(qū)出現(xiàn)的δc?213.26和δc?176.14兩個季碳信號為羰基碳信號。δc?111.21和δc?151.54推測為母核上雙鍵碳信號，其中δc?111.21為叔碳信號，這說明母核上雙鍵位于9(11)位。δc?105.93、δc?105.81、δc?105.65和δc?105.44推測為糖的端基碳信號。13c?nmr譜中共給出8個伯碳信號，分別為δc?60.98、δc?18.21、δc?22.30、δc?26.96、δc?22.45、δc16.88、δc?28.68和δc?20.84，其中δc?60.98應(yīng)為-och3的碳信號，推測化合物mj-1的糖基中可能含有3-甲基葡萄糖，δc18.21為喹諾糖中甲基的特征信號，推測化合物mj-1的糖基中可能含有喹諾糖。化合物mj-1的1h?nmr(c5d5n,600mhz)譜中給出8個甲基質(zhì)子信號，結(jié)合hsqc譜和h1-h1cosy譜分析可知，δh?1.30(s,h-19)、δh?1.27(s,h-21)、δh1.57(s,h-27)、δh?1.04(s,h-28)、δh?1.46(s,h-29)和δh?0.78(s,h-30)這6個h信號是海參烷骨架結(jié)構(gòu)的特征甲基質(zhì)子信號，而δh?1.64(d,j＝6.0hz)為糖鏈上喹諾糖中的甲基質(zhì)子信號，δh3.74(s)為糖鏈上3-甲基葡萄糖中的甲氧基質(zhì)子信號。低場區(qū)δh?5.07(d,j＝7.2hz)、δh?4.70(d,j＝7.2hz)、δh?5.20(d,j＝7.8hz)和δh?4.72(d,j＝7.8hz)這4組質(zhì)子信號可分別歸屬為糖的端基質(zhì)子信號，可以推測化合物mj-1中可能存在四分子糖，由于它們的j值均大于7.2hz，可知糖的構(gòu)型均為β-d構(gòu)型。在hmbc譜中，木糖的端基質(zhì)子信號δh?4.70(d,j＝7.2hz)與δc89.06(c-3)遠程相關(guān)，可以判斷母核的c-3位連接一分子木糖。喹諾糖的端基質(zhì)子信號δh5.07(d,j＝7.2hz)與連接母核的木糖的c-2位碳信號δc?84.42存在遠程相關(guān)，說明葡萄糖與該木糖2位相連。另一分子木糖的端基質(zhì)子信號δh4.72(d,j＝7.2hz)與喹諾糖的c-4位碳信號δc?86.21存在遠程相關(guān)，說明該木糖連接于喹諾糖的4位。3-甲基葡萄糖的端基質(zhì)子信號δh?5.20(d,j＝7.8hz)與上述木糖的c-3位碳信號δc?87.59存在遠程相關(guān)，說明3-甲基葡萄糖與該木糖3位相連。結(jié)合1h-1h?cosy，hsqc，hmbc和文獻相互佐證，最終確定化合物mj-1為3β-o-[3-o-甲基-β-d-吡喃葡萄糖-(1→3)-β-d-吡喃木糖-(1→4)-β-d-吡喃喹諾糖-(1→2)-β-d-吡喃木糖]-海參烷-9(11),25(26)-二烯-16-酮。經(jīng)文獻檢索，確認化合物mj-1為cladoloside?a。cladoloside?a的13c?nmr和1h?nmr化學(xué)位移值見表1。

20、表1化合物mj-1的13c?nmr和1h?nmr數(shù)據(jù)(c5d5n,150/600mhz,δ,ppm)

21、

22、

23、分析化合物cladoloside?a純度的hplc-elsd色譜條件如下：

24、色譜柱-agilent?eclipse?xdb-c18(5μm,4.6×250mm)；流動相-甲醇-水(64:36)；流速-1ml/min；柱溫-37.5℃；進樣量-20μl；

25、elsd檢測器漂移管溫度95℃；撞擊狀態(tài)-關(guān)閉；載氣壓力-0.45mpa；霧化器流速-2.0l/min；放大倍數(shù)-1.0倍。