本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，特別涉及一種大規(guī)模測定核酸序列翻譯效率的建庫方法。

背景技術(shù)：

1、植物在自然界中隨時會面臨病原微生物的侵染，為了預(yù)防和抵抗病原微生物的入侵，在漫長的演化過程中植物形成了多層次的免疫系統(tǒng)。一般而言，植物的免疫系統(tǒng)包括pattern?triggered?immunity?(pti)?(couto?and?zipfel,?2016)、effector-triggeredimmunity?(eti)?(jones?and?dangl,?2006)和系統(tǒng)獲得抗性(systemic?acquiredresistance,?sar)(gaffney?et?al.,?1993)。病原微生物表面保守的分子模式(pathogen-associated?molecular?patterns,?pamps)能夠被植物細(xì)胞膜上的模式識別受體(pattern-recognition?receptors,?prrs)所識別，快速激活廣譜的免疫反應(yīng)pti。植物響應(yīng)病原微生物的前期免疫反應(yīng)包括活性氧(ros)的產(chǎn)生、細(xì)胞質(zhì)鈣離子濃度的變化以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated?protein?kinase,?mapk)信號通路的激活。病原微生物通過分泌效應(yīng)因子(effectors)進(jìn)入細(xì)胞從而導(dǎo)致植物感?。惶囟ǖ男?yīng)因子可以被細(xì)胞內(nèi)的免疫受體(nucleotide-binding?domain?(nbd)?and?leucine-rich?repeat(lrr)?receptors,?nlrs)所識別，激活特異性的免疫反應(yīng)eti，并通常伴隨細(xì)胞的程序性死亡。系統(tǒng)獲得抗性(sar)是植物在遭受局部病原體侵襲后，在全株范圍內(nèi)產(chǎn)生的一種廣譜、持久的抗性狀態(tài)。

2、真核基因表達(dá)始于細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本大致分為編碼蛋白質(zhì)的rna(即mrna)和非編碼rna，盡管有些非編碼rna也被發(fā)現(xiàn)可以翻譯。轉(zhuǎn)錄完成后，初級轉(zhuǎn)錄本或前體mrna(pre-mrna)會經(jīng)歷一系列加工過程，包括添加5'帽子和3'多聚腺苷酸尾以及剪接。當(dāng)成熟的mrna被運出細(xì)胞核后，通常就準(zhǔn)備好進(jìn)行翻譯。然而，在某些情況下，mrna可能會被降解或儲存，從而阻止其翻譯。

3、翻譯過程在酵母和動物系統(tǒng)中已被詳細(xì)研究，包括起始、延長、終止和核糖體再利用(jackson?et?al.,?2010)。當(dāng)mrna進(jìn)入翻譯系統(tǒng)后，翻譯機器(主要由核糖體、trna和翻譯因子組成)執(zhí)行這些步驟。這些成分對mrna的翻譯至關(guān)重要。上游翻譯調(diào)控因子包括蛋白質(zhì)(如rna結(jié)合蛋白和激酶)、代謝物(如離子和atp)以及rna(如小rna)。當(dāng)細(xì)胞接收到發(fā)育或環(huán)境信號時，這些調(diào)控因子通過調(diào)節(jié)翻譯機器成分的可用性、組成和活性來實現(xiàn)翻譯控制。它們可以全局重編程或基因特異性地改變mrna翻譯效率(tre)，最終決定全局蛋白質(zhì)組或特定蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量。因此，翻譯機器是翻譯控制的基礎(chǔ)。

4、5′-leader（又稱為5′非翻譯區(qū)或5′-utr）是mrna的重要結(jié)構(gòu)和功能區(qū)域，對mrna的翻譯有直接或間接的影響。通過對5′-leader序列進(jìn)行深入研究，可以揭示其在調(diào)控mrna翻譯過程中的機制，并為植物基因功能的研究提供新的視角。因此有必要對5′-leader序列進(jìn)行深入研究從而開發(fā)一種大規(guī)模測定核酸序列翻譯效率的建庫方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的是提供一種大規(guī)模測定核酸序列翻譯效率的建庫方法，不僅為進(jìn)一步理解植物免疫應(yīng)答機制提供了新的工具和方法，也為基因功能研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的目的在于提供了一種大規(guī)模測定核酸序列翻譯效率的建庫方法，所述建庫方法包括：

4、選取模式植物擬南芥內(nèi)源5’-leaders，根據(jù)5’-leaders長度為50-150?nt區(qū)間的序列和5’-leaders長度大于150?nt的序列分別進(jìn)行構(gòu)建，獲得兩種5’-leaders文庫；

5、通過載體無縫連接分別將所述5’-leaders文庫構(gòu)建獲得兩種質(zhì)粒文庫；

6、將所述兩種質(zhì)粒文庫混合后侵染煙草葉片，后提取煙草注射部位的總rna，并對不同核糖體結(jié)合的rna組分進(jìn)行分離，獲得分離出來的rna；

7、對所述分離出來的rna進(jìn)行建庫、測序，獲得測序數(shù)據(jù)；

8、對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和分析，且對不同的轉(zhuǎn)錄本的翻譯能力進(jìn)行賦值，從而獲得核酸序列的翻譯效率。

9、進(jìn)一步地，所述根據(jù)5’-leaders長度為50-150?nt區(qū)間的序列和5’-leaders長度大于150?nt的序列分別進(jìn)行構(gòu)建，獲得兩種5’-leaders文庫，具體包括：

10、對于5’-leaders長度為50-150?nt區(qū)間的序列，采用基因芯片合成的方式制備合成9836種不同的序列，獲得基因芯片樣品溶液，后使用上下游接頭引物對所述基因芯片樣品溶液pcr擴增，獲得pcr產(chǎn)物，后將所述pcr產(chǎn)物與目標(biāo)載體psy105-x通過 bsai限制性內(nèi)切酶和t4-dna?ligase無縫連接，從而構(gòu)建第一種5’-leaders文庫；

11、對于5’-leaders長度大于150?nt的序列，通過對每條序列設(shè)計特異性引物，分別擴增出1232種5’-leaders?dna，通過對所述1232種5’-leaders?dna分別設(shè)計引物分別擴增獲得1232組pcr產(chǎn)物，后將所有擴增的pcr產(chǎn)物混合，通過 bsai限制性內(nèi)切酶和t4-dnaligase將5′-leaders無縫連接到目標(biāo)載體psy105-x，獲得第二種5’-leaders文庫。

12、進(jìn)一步地，所述通過載體無縫連接分別將所述5’-leaders文庫構(gòu)建，獲得兩種質(zhì)粒文庫，具體包括：

13、將pcont-free質(zhì)粒分別與所述5’-leaders文庫酶切和連接，獲得兩種質(zhì)粒文庫。

14、進(jìn)一步地，所述分離出來的rna進(jìn)行建庫、測序，獲得測序數(shù)據(jù)，具體包括：

15、對于不同組分的rna，使用帶有fraction-index的特異性反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄后的cdna產(chǎn)物混合，并建立ngs文庫，通過fraction-index區(qū)分不同的rna組分來源。

16、進(jìn)一步地，所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行提取和分析，且對不同的轉(zhuǎn)錄本的翻譯能力進(jìn)行賦值，從而獲得核酸序列的翻譯效率，具體包括：

17、對不同的5′-leaders轉(zhuǎn)錄本計算其mrl值，并對所述mrl值進(jìn)行相關(guān)性分析，從而獲得核酸序列的翻譯效率。

18、mrl值（mean?ribosome?loading，平均核糖體負(fù)載）是指在特定mrna上檢測到的核糖體數(shù)量的平均值，是一個衡量翻譯效率的指標(biāo)。mrl值越大?翻譯效率越大。

19、進(jìn)一步地，通過polysome?profiling試驗，每個樣品均能檢測到10個組分，檢測特定mrna在各組分的分布，并通過標(biāo)準(zhǔn)化處理，最終得到每條mrna的mrl值，以此反映其翻譯效率的程度。

20、本發(fā)明實施例中的一個或多個技術(shù)方案，至少具有如下技術(shù)效果或優(yōu)點：

21、本發(fā)明提供一種大規(guī)模測定核酸序列翻譯效率的建庫方法，本發(fā)明通過對5’-leaders分析并建庫，對不同的轉(zhuǎn)錄本的翻譯能力進(jìn)行賦值，從而獲得核酸序列的翻譯效率。