本發(fā)明屬于生物工程，具體涉及一種β-1,4-甘露聚糖酶及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、刺槐豆膠也被稱為槐豆膠、角豆膠，通常為白色無(wú)味粉末，融水后呈透明度較高的凝膠狀，是產(chǎn)自地中海一帶的刺槐樹(shù)種子經(jīng)過(guò)分離精制出的一種植物膠，低溫下部分溶解，需要持續(xù)加熱并保溫才能溶解充分。其含有非常豐富的異甘露聚糖，即半乳甘露聚糖，主鏈由甘露聚糖構(gòu)成，甘露糖殘基與半乳糖作為結(jié)構(gòu)單元以1,6-α-糖苷鍵連接形成支鏈，因其吸水后粘度較大，可被用作增稠劑、絮凝劑和持水劑，運(yùn)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)。刺槐豆膠的降解過(guò)程中發(fā)揮主要作用的酶就是β-1,4-甘露聚糖酶，降解后可以降低刺槐豆膠的粘性，生產(chǎn)和提取甘露寡糖進(jìn)一步利用。

2、β-甘露聚糖酶屬于半纖維素酶類，是一類內(nèi)切水解酶，是水解甘露聚糖β-1,4-連接骨架的主要酶，能夠水解甘露聚糖和半乳甘露聚糖中主鏈的β-1,4-甘露糖苷鍵。依據(jù)氨基酸序列相似性及結(jié)構(gòu)特性，β-甘露聚糖酶來(lái)自gh5家族，催化結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)均為(β/α)8-ti?m桶狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)水解甘露聚糖時(shí)，該酶可隨機(jī)水解其主鏈上的β-1,4-糖苷鍵，使甘露聚糖主鏈被截?cái)?，從而降解為低聚糖混合物，酶解產(chǎn)生的低聚糖也具有豐富的利用價(jià)值，其中甘露寡糖因其內(nèi)源結(jié)構(gòu)具有特殊生物調(diào)節(jié)功能和保健功能，例如抗過(guò)敏、激活巨噬細(xì)胞活性等，可以生產(chǎn)用作食品添加劑和營(yíng)養(yǎng)素，因此被廣泛運(yùn)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。目前，市面上存在的β-甘露聚糖酶耐熱性往往達(dá)不到工業(yè)要求，導(dǎo)致其在生產(chǎn)運(yùn)輸過(guò)程中生物活性不穩(wěn)定，嚴(yán)重限制該酶應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)具有優(yōu)良耐熱性的β-甘露聚糖酶具有重要工業(yè)意義和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)中的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明提出了一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，其在不降低酶的催化活力的前提下，提高酶的熱穩(wěn)定性，為β-1,4-甘露聚糖酶更好應(yīng)用于甘露寡糖的制備提供理論依據(jù)。

2、為此，在本發(fā)明的第一個(gè)方面中，提供一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，所述突變體是將β-1,4-甘露聚糖酶第325位的glu突變?yōu)閙et，突變體e325m的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

3、根據(jù)本發(fā)明的一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，所述突變體是將野生型β-1,4-甘露聚糖酶的第325位的谷氨酸突變?yōu)榈鞍彼?，與野生型β-1,4-甘露聚糖酶相比，所述突變體的酶活力提高約31％；在60℃處理60min后，突變體e325m的殘余活力比野生型高出17％左右，從而使該熱穩(wěn)定性提高的β-1,4-甘露聚糖酶突變體在甘露寡糖工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

4、在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種編碼上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因，突變體e325m的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

5、在本發(fā)明的第三個(gè)方面中，提供了一種構(gòu)建體，其包含編碼上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因。

6、在本發(fā)明的第四個(gè)方面中，提供了一種制備上述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的制備方法，包括：

7、利用fireprot在線服務(wù)器進(jìn)行β-1,4-甘露聚糖酶折疊自由能δδg變化分析顯示，結(jié)合foldx和rosetta預(yù)測(cè)β-1,4-甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性提高的突變位點(diǎn)，再結(jié)合序列保守性分析篩選鑒定得酶活和熱穩(wěn)定性均提高的突變體；

8、將野生型β-1,4-甘露聚糖酶在其第325位的突變位點(diǎn)進(jìn)行突變，得到所述β-1,4-甘露聚糖酶突變體。

9、根據(jù)本發(fā)明的，通過(guò)理性設(shè)計(jì)的方法對(duì)β-1,4-甘露聚糖酶的折疊自由能進(jìn)行改造來(lái)提高酶的熱穩(wěn)定性；采用定點(diǎn)突變技術(shù)，以β-1,4-甘露聚糖酶的基因?yàn)槟０澹瑯?gòu)建了e325m突變體，與野生型β-1,4-甘露聚糖酶(wt)相比，突變體e325m的酶活力提高約31％，同時(shí)突變體e325m的熱穩(wěn)定性大幅提高，在60℃處理60min后，與野生型β-1,4-甘露聚糖酶相比，突變體e325m保留了51％的殘余酶活力，而野生型酶保留了33％的殘余酶活力，突變體e325m的殘余活力比野生型高出17％左右；對(duì)突變體e325m進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)該酶的最適反應(yīng)溫度和最適ph與野生型一致，分別為60℃、5.0，能專一性降解刺槐豆膠，ph穩(wěn)定性無(wú)明顯變化；基于折疊自由能變化的理性設(shè)計(jì)策略能夠?yàn)楣I(yè)酶的熱穩(wěn)定性改造提供思路，并對(duì)刺槐豆膠的高值化利用及分子改造具有重要意義。

10、在本發(fā)明的第五個(gè)方面中，提供了上述β-1,4-甘露聚糖酶突變體在酶解刺槐豆膠制備甘露寡糖中的應(yīng)用。

11、本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

技術(shù)特征：

1.一種β-1,4-甘露聚糖酶突變體，其特征在于，包括以下步驟：所述突變體是將β-1,4-甘露聚糖酶第325位的glu突變?yōu)閙et，突變體e325m的氨基酸序列如seq?id?no：1所示。

2.一種編碼權(quán)利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的基因，其特征在于，突變體e325m的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。

3.一種構(gòu)建體，其特征在于，包含如權(quán)利要求2所述的基因。

4.一種制備權(quán)利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體的制備方法，其特征在于，包括：

5.如權(quán)利要求1所述的β-1,4-甘露聚糖酶突變體在酶解刺槐豆膠制備甘露寡糖中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供了一種β?1,4?甘露聚糖酶及其應(yīng)用，該突變體是將β?1,4?甘露聚糖酶第325位的Glu突變?yōu)镸et，該突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。與野生型β?1,4?甘露聚糖酶相比，所述突變體的酶活力提高約31％；在60℃處理60min后，突變體的殘余活力比野生型高出17％左右，從而使該熱穩(wěn)定性提高的β?1,4?甘露聚糖酶突變體在甘露寡糖工業(yè)生產(chǎn)中具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：朱艷冰,周婕,倪輝,姜澤東,王興華,鄭明靜,洪濤,李志朋,杜希萍,陳艷紅,楊遠(yuǎn)帆
受保護(hù)的技術(shù)使用者：集美大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/6