本發(fā)明屬于基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體是一種穩(wěn)定性提高的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體及其穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、凝血酶是反映凝血發(fā)生的標(biāo)志物，其半衰期極短，只有幾秒鐘，直接測定很困難。凝血酶形成后迅速與抗凝血酶(antithrombin，at)共價結(jié)合形成凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(thrombin-antithrombin?complex，tat)，在血漿的半衰期約3～15分鐘，可間接反映凝血酶的生成量，是凝血系統(tǒng)啟動的標(biāo)志，可直接、靈敏地反映凝血系統(tǒng)的活化程度，并進(jìn)一步早期預(yù)測血栓的形成和再栓的復(fù)發(fā)，具有重要臨床意義。

2、目前tat的檢測方法主要是化學(xué)發(fā)光法，進(jìn)口已上市產(chǎn)品僅有希森美康醫(yī)用電子有限公司生產(chǎn)的tat檢測試劑盒，國內(nèi)市場較成熟的類似產(chǎn)品稀缺。質(zhì)控品作為化學(xué)發(fā)光試劑的重要組成部分，主要作用是評估和監(jiān)控檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，同時還可以幫助實驗室識別潛在的問題，并及時采取糾正措施，對臨床檢測具有重大意義。質(zhì)控品核心成分為凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物蛋白，該蛋白為異源三聚體，空間構(gòu)象極其復(fù)雜，凝血酶是由兩條多肽鏈組成，a鏈含有36個氨基酸殘基，b鏈含有259個氨基酸殘基，兩條鏈通過二硫鍵共價連接，再與抗凝血酶共價結(jié)合，形成凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物。天然凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物純品尚未見有商品出售，在血清中含量很少，不足以提取，其蛋白穩(wěn)定性差，重組表達(dá)困難，這給其應(yīng)用帶來了一定的困難。

3、市面現(xiàn)有的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品均存在穩(wěn)定性不好的問題，會直接導(dǎo)致待檢測目標(biāo)物的降解或變性，最終導(dǎo)致檢測試劑檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性降低，如希森美康醫(yī)用電子有限公司生產(chǎn)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品(注冊證編號：國械注進(jìn)20162404951)有效期9個月，開瓶復(fù)溶后僅限當(dāng)天使用。申請?zhí)枮?02410069367.2的發(fā)明專利公開了一種tat質(zhì)控品的制備方法及其應(yīng)用，向豬血漿中加入豬凝血酶，凝血酶與血漿中的抗凝血酶結(jié)合形成凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物，然后配制并凍干得到tat質(zhì)控品，然而豬源性凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物與人源性凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物差異較大，其用于人醫(yī)檢測的特異性和一致性難以保證。

4、鑒于此，開發(fā)穩(wěn)定性較好、具有潛在應(yīng)用價值的人凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物蛋白或其表達(dá)細(xì)胞株及用于檢測血栓類疾病的質(zhì)控品具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明利用基于晶體結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)折疊自由能的理論設(shè)計對凝血酶b鏈(氨基酸序列如seq?id?no.1，pdb?id：4h6t)和抗凝血酶(氨基酸序列如seq?id?no.3，pdb?id：1ant)進(jìn)行分子改造，將多個氨基酸進(jìn)行定點突變，從而獲得穩(wěn)定性提高的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體，進(jìn)一步提供凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品的制備方法及其應(yīng)用，解決了用于檢測血栓類疾病的質(zhì)控品穩(wěn)定性差、資源耗費大的問題。

2、在本發(fā)明的一個實施例中，所述突變體是將氨基酸序列如seq?id?no.1所示的凝血酶b鏈的第198位的脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?，命名為p198f，其氨基酸序列如seq?id?no.4所示，同時將如seq?id?no.3所示的抗凝血酶的第217位的天冬酰胺突變?yōu)楸奖彼?、?27位的天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?14位的谷氨酸突變?yōu)槔野彼岬玫降?，命名為n217f/d327i/e414y，其氨基酸序列如seq?id?no.5所示。

3、本發(fā)明還提供了一種編碼上述凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體的基因。

4、本發(fā)明還提供了攜帶上述基因的重組載體。

5、在本發(fā)明的一個實施例中，以pcho1.0質(zhì)粒為重組載體。

6、本發(fā)明還提供了一種二氫葉酸還原酶缺陷型(dhfr-)中國倉鼠卵巢細(xì)胞(cho-tat-clone?35)，所述的cho-tat-clone?35細(xì)胞株整合上述基因或重組載體，可以穩(wěn)定高效的表達(dá)穩(wěn)定性提高的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體。

7、本發(fā)明還提供上述突變體的制備方法，具體步驟為：(1)用上述重組載體轉(zhuǎn)染chodg44細(xì)胞，經(jīng)嘌呤霉素和甲氨蝶呤篩選得重組細(xì)胞株；(2)培養(yǎng)重組細(xì)胞株，離心分離上清，親和純化得到凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體。

8、本發(fā)明還提供了上述凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體，或上述基因，或上述重組載體，或上述重組細(xì)胞株在制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品中的應(yīng)用。

9、該質(zhì)控品的原輔料包括：小牛血清、牛血清白蛋白2％、海藻糖3％、4％乳糖、3％聚乙二醇、防腐劑0.2％，經(jīng)真空冷凍干燥得到凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品。

10、本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果：

11、(1)本發(fā)明的cho-tat-clone?35細(xì)胞株可以高效的表達(dá)穩(wěn)定性顯著提高的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體，為高品質(zhì)凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物的大規(guī)模生產(chǎn)，提供了更經(jīng)濟的方法；

12、(2)本發(fā)明的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品穩(wěn)定性好，成本低，使用方便，可用于凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物臨床檢驗的質(zhì)量控制，保障檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，具有巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。

技術(shù)特征：

1.一種凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體，其特征在于，所述突變體是將氨基酸序列seqid?no.1所示的凝血酶b鏈的第198位的脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?，同時將seq?id?no.3所示的抗凝血酶的第217位的天冬酰胺突變?yōu)楸奖彼帷⒌?27位的天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?14位的谷氨酸突變?yōu)槔野彼岬玫降摹?/p>

2.一種編碼權(quán)利要求1所述凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體的基因。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體的基因，其特征在于，所述基因序列如seq?id?no.6、seq?id?no.7、seq?id?no.8。

4.一種攜帶權(quán)利要求2或者權(quán)利要求3所述基因的重組載體。

5.一種基于權(quán)利要求2、3或者4的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞。

6.一種基于權(quán)利要求4所述的重組載體制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

7.權(quán)利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體，在制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品中的應(yīng)用。

8.權(quán)利要求2或3所述的基因，在制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品中的應(yīng)用。

9.權(quán)利要求4所述的重組載體，在制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品中的應(yīng)用。

10.權(quán)利要求5所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，在制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品中的應(yīng)用。

11.一種制備凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物突變體或權(quán)利要求5所述的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的培養(yǎng)物添加至小牛血清，同時加入2％牛血清白蛋白、3％海藻糖、4％乳糖、3％聚乙二醇、0.2％防腐劑，經(jīng)真空冷凍干燥制備得到。

技術(shù)總結(jié)
本申請公開了一種穩(wěn)定性提高的凝血酶?抗凝血酶復(fù)合物突變體及其穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞和應(yīng)用，所述突變體是將氨基酸序列SEQ?ID?NO.1所示的凝血酶B鏈的第198位的脯氨酸突變?yōu)楸奖彼?，同時將SEQ?ID?NO.3所示的抗凝血酶的第217位的天冬酰胺突變?yōu)楸奖彼帷⒌?27位的天冬氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?、?14位的谷氨酸突變?yōu)槔野彼岬玫降?，得到穩(wěn)定性顯著提升的凝血酶?抗凝血酶復(fù)合物突變體，將該突變體加入小牛血清，真空冷凍干燥得到凝血酶?抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品，解決了用于檢測血栓類疾病凝血酶?抗凝血酶復(fù)合物質(zhì)控品的穩(wěn)定性差、資源耗費大的問題。

技術(shù)研發(fā)人員：鄧春泉,付裕,楊曉寧,李易,洪龍斌,周旭一
受保護的技術(shù)使用者：杭州博茵生物技術(shù)有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/30