本發(fā)明屬于生物，涉及一種抗諾如病毒的單克隆抗體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、諾如病毒(英語：norovirus、wintervomiting?bug，縮寫：nv)，又稱為諾羅病毒、諾瓦克病毒或膿融病毒，是一種引起非細(xì)菌性急性胃腸炎的病毒。諾如病毒的特征是感染人口密度較高和衛(wèi)生環(huán)境差的地方，如郵輪。諾如病毒主要由糞口途徑傳染，即食物被充滿病毒的糞便污染所致，在人口密度高的地方也可能透過飛沫傳染。

2、諾如病毒又按遺傳基因分為基因群ⅰ和基因群ⅱ?；蛉孩?genogroup?i)里有諾如病毒、南安普頓病毒(southampton?virus)、沙漠盾牌病毒(desert?shield?virus)；基因群ⅱ(genogroupⅱ)里有雪山病毒(snow?mountain?virus)、夏威夷病毒(hawaii?virus)、多倫多病毒(toronto?virus)。一般癥狀主要有腹痛、腹瀉、嘔吐、低燒、全身肌肉酸痛等。癥狀一般維持12至60小時(shí)后自行消退，但病毒的排泄會(huì)延續(xù)2星期左右。如腹瀉厲害，容易發(fā)生脫水、休克等癥狀。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下的技術(shù)方案：

2、本發(fā)明提供了抗vp1蛋白的單克隆抗體，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)包括含氨基酸序列如seq?id?no:1-3所示的互補(bǔ)決定區(qū)hcdr1、hcdr2和hcdr3，輕鏈可變區(qū)包括氨基酸序列如seq?id?no:4-5所示的互補(bǔ)決定區(qū)lcdr1和lcdr3，輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)lcdr2的氨基酸序列為nak。

3、進(jìn)一步，所述抗vp1蛋白是抗諾如病毒1型vp1蛋白。

4、進(jìn)一步，所述單克隆抗體還包括重鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4和輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4。

5、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4分別具有與seqid?no:6-9所述的氨基酸序列至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，優(yōu)選至少80％同一性，優(yōu)選至少85％同一性，優(yōu)選至少90％同一性，優(yōu)選至少95％同一性，優(yōu)選至少96％同一性，優(yōu)選至少97％同一性，優(yōu)選至少98％同一性，優(yōu)選至少99％同一性。

6、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4分別具有與seqid?no:10-13所述的氨基酸序列至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，優(yōu)選至少80％同一性，優(yōu)選至少85％同一性，優(yōu)選至少90％同一性，優(yōu)選至少95％同一性，優(yōu)選至少96％同一性，優(yōu)選至少97％同一性，優(yōu)選至少98％同一性，優(yōu)選至少99％同一性。

7、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列如seq?id?no:6-9所示，輕鏈可變區(qū)的框架區(qū)fr1、fr2、fr3、fr4的氨基酸序列如seq?id?no:10-13所示。

8、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有與seq?id?no:14所述的氨基酸序列至少60％同一性，優(yōu)選至少65％同一性，優(yōu)選至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，優(yōu)選至少80％同一性，優(yōu)選至少85％同一性，優(yōu)選至少90％同一性，優(yōu)選至少95％同一性，優(yōu)選至少96％同一性，優(yōu)選至少97％同一性，優(yōu)選至少98％同一性，優(yōu)選至少99％同一性。

9、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列具有與seq?id?no:15所述的氨基酸序列至少60％同一性，優(yōu)選至少65％同一性，優(yōu)選至少70％同一性，優(yōu)選至少75％同一性，優(yōu)選至少80％同一性，優(yōu)選至少85％同一性，優(yōu)選至少90％同一性，優(yōu)選至少95％同一性，優(yōu)選至少96％同一性，優(yōu)選至少97％同一性，優(yōu)選至少98％同一性，優(yōu)選至少99％同一性。

10、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:14所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:15所示。

11、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的cdr劃分還可以使用于kabat、imgt、chothia、abm或contact編號(hào)系統(tǒng)進(jìn)行。

12、進(jìn)一步，所述單克隆抗體的cdr劃分以重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:14所示，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seq?id?no:15所示為基本序列。

13、本文所使用的術(shù)語“序列同一性”、“同一性”同義，是指兩個(gè)多核苷酸之間的“序列同一性百分比”或“同一性百分比”，即在考慮到了為了兩個(gè)序列的最佳比對(duì)而必須引入的添加或缺失(即，空位)的情況下，比較窗口內(nèi)序列所共有的相同匹配位置的數(shù)量。匹配位置是其中在靶序列和參考序列中都存在相同核苷酸的任何位置。由于空位不是核苷酸，所以靶序列中存在的空位不計(jì)在內(nèi)。同樣，由于計(jì)入靶序列核苷酸，而不計(jì)來自參考序列的核苷酸，所以不計(jì)參考序列中存在的空位。至少60％序列同一性包括所述序列全長的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％具有序列同一性的連續(xù)片段?！靶蛄型恍园俜直取笨赏ㄟ^以下來計(jì)算：對(duì)比窗口中的兩個(gè)最佳比對(duì)序列、確定在兩個(gè)序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如a、t、c、g、i)或相同氨基酸殘基(例如ala、pro、ser、thr、gly、val、leu、ile、phe、tyr、trp、lys、arg、his、asp、glu、asn、gln、cys和met)的位置數(shù)量以得到匹配位置的數(shù)量、將匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中的位置總數(shù)(即窗口大小)，并且將結(jié)果乘以100以得到序列同一性百分比。

14、本文中使用的術(shù)語“抗體”通常由兩對(duì)多肽鏈(每對(duì)具有一條輕鏈(lc)和一條重鏈(hc))組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ(kappa)和λ(lambda)輕鏈。重鏈可分類為μ、δ、γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為igm、igd、igg、iga和ige。在輕鏈和重鏈內(nèi)，可變區(qū)和恒定區(qū)通過大約12或更多個(gè)氨基酸的“j”區(qū)連接，重鏈還可以包含大約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的“d”區(qū)。各重鏈由重鏈可變區(qū)(vh)和重鏈恒定區(qū)(ch)組成。重鏈恒定區(qū)由3個(gè)結(jié)構(gòu)域(ch1、ch2和ch3)組成。各輕鏈由輕鏈可變區(qū)(vl)和輕鏈恒定區(qū)(cl)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域cl組成。恒定結(jié)構(gòu)域不直接參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)子功能，如可介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(例如，效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(c1q)的結(jié)合。vh和vl區(qū)還可被細(xì)分為具有高變性的區(qū)域(稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr))，其間散布有較保守的稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的區(qū)域。各vh和vl由按下列順序：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4從氨基末端至羧基末端排列的3個(gè)cdr和4個(gè)fr組成。各重鏈，輕鏈中的可變區(qū)(vh和vl)分別形成抗原結(jié)合部位。

15、在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供是單克隆抗體的“抗諾如病毒1型vp1蛋白抗體”。單克隆抗體指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即構(gòu)成所述抗體群的單個(gè)抗體除可能的可少量存在的天然發(fā)生的突變外是相同的。修飾詞“單克隆”指得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體的特征，并且不解釋為需要通過任何具體方法產(chǎn)生抗體。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過由kohler?et?al.，nature，256：495(1975)首次描述的雜交瘤(鼠類或人的)方法制備，或可通過重組dna方法(參見例如，us?4,816,567)制備?！皢慰寺】贵w”也可使用例如clackson?etal.，nature，352：624-628(1991)和marks?et?al.，jmol.biol.，222：581-597(1991)中所述技術(shù)從噬菌體抗體文庫中分離。還應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的某些實(shí)施方案涉及含一種以上的不同單克隆抗體的組合物，所述單克隆抗體特異性結(jié)合vp1蛋白，即含具有不同表位特異性的多種單克隆抗體的多克隆抗體組合物。

16、本發(fā)明提供了一種核酸分子，所述核酸分子編碼前面所述的單克隆抗體。

17、進(jìn)一步，所述核酸分子包括dna、cdna、mrna、重組核酸。

18、進(jìn)一步，所述核酸分子的核苷酸序列是經(jīng)過密碼子優(yōu)化的。

19、本發(fā)明所用術(shù)語“核酸”旨在包括任何長度的核苷酸的聚合形式，其含有脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其類似物，其包括dna、rna和dna/rna雜合物，其還包括dna或rna類似物，諸如含有修飾的骨架(例如肽核酸(pna)或硫代磷酸酯)或修飾的堿基的那些。因此，本發(fā)明的核酸包括dna、cdna、mrna、重組核酸等。

20、本發(fā)明提供了一種載體，所述載體包括前面所述的核酸分子。

21、進(jìn)一步，所述載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(例如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭狀瘤病毒、乳多空病毒、λ噬菌體、m13噬菌體、質(zhì)粒。

22、本文所使用的術(shù)語“載體”，在將上述分離的核酸分子連接到載體上時(shí)，可以將核酸序列與載體上的調(diào)控元件直接或者間接相連，只要這些調(diào)控元件能夠調(diào)控該核酸分子的翻譯和表達(dá)等即可。當(dāng)然這些調(diào)控元件可以直接來自于載體本身，也可以是外源性的，即并非來自于載體本身。也就是說，核酸分子與調(diào)控元件可操作地連接。常用的載體例如原核表達(dá)載體、真核表達(dá)載體或病毒表達(dá)載體等等。

23、在一些實(shí)施方案中，具體載體的選擇將取決于靶細(xì)胞和所處理的條件。導(dǎo)入可通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)例如，感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)化。基因轉(zhuǎn)移模式的實(shí)例包括例如，裸dna、capo4沉淀、deae聚葡糖、電穿孔、原生質(zhì)體融合、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、細(xì)胞顯微注射和病毒載體。

24、本發(fā)明提供了一種細(xì)胞，所述細(xì)胞包括前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體。

25、進(jìn)一步，所述細(xì)胞包括真核細(xì)胞和原核細(xì)胞。

26、進(jìn)一步，所述原核細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞、大腸桿菌、鏈霉菌。

27、進(jìn)一步，所述真核細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞。

28、進(jìn)一步，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、山羊、綿羊、牛、豬、犬、貓。

29、進(jìn)一步，所述真核細(xì)胞包括人類細(xì)胞、小鼠細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、倉鼠細(xì)胞、山羊細(xì)胞、綿羊細(xì)胞或任何其它細(xì)胞。

30、進(jìn)一步，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括a549，wehi，3t3，10t1/2，bhk，mdck，cos1，cos7，bsc1，bsc40，bmt10，vero，wi38，hela，293細(xì)胞(可以表達(dá)功能性的腺病毒e1)，saos，c2c12，l細(xì)胞，ht1080，hepg2。

31、進(jìn)一步，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞和成肌細(xì)胞。

32、本發(fā)明提供了一種綴合物，所述綴合物包括前面所述的單克隆抗體及其直接或間接綴合的可連接物。

33、進(jìn)一步，所述可連接物包括可檢測(cè)標(biāo)記物、藥物、毒素、細(xì)胞因子、放射性核素、或酶。

34、本文中使用的術(shù)語“可檢測(cè)標(biāo)記物”是指任何部分，該部分通過與該部分偶聯(lián)的分子狀態(tài)的光學(xué)、電學(xué)或其它物理指標(biāo)的改變生成可測(cè)定信號(hào)。此類物理指標(biāo)包括光譜、光化學(xué)、生物化學(xué)、免疫化學(xué)、電磁、放射化學(xué)和化學(xué)手段，例如但不限于熒光、化學(xué)熒光和化學(xué)發(fā)光等。在關(guān)于經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)劑使用時(shí)，“直接標(biāo)記物”是通過任何手段附著至檢測(cè)劑的可檢測(cè)標(biāo)記物。在關(guān)于經(jīng)標(biāo)記的檢測(cè)劑使用時(shí)，“間接標(biāo)記物”是特異性結(jié)合檢測(cè)劑的可檢測(cè)標(biāo)記物。因此，間接標(biāo)記物包括下述部分：檢測(cè)劑的特異性結(jié)合伴侶。生物素和親和素是所采用的此類部分的實(shí)例，例如通過使生物素化抗體與經(jīng)標(biāo)記的親和素接觸以產(chǎn)生間接標(biāo)記的抗體來應(yīng)用。

35、在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)記可以選自同位素標(biāo)記、同量異位素標(biāo)記、酶標(biāo)記、有色標(biāo)記、熒光標(biāo)記、生色標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、半抗原、生物素、金屬絡(luò)合物、金屬和膠體金等，其中同位素標(biāo)記和同量異位素標(biāo)記是特別優(yōu)選的。

36、本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，前面所述的細(xì)胞，和/或前面所述的綴合物。

37、進(jìn)一步，所述藥物組合物在全身施用，具體通過鼻內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、腹腔內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、皮內(nèi)途徑、皮下途徑、真皮下途徑、透皮途徑、顱內(nèi)途徑、粘膜途徑、肛門途徑、陰道途徑、口腔途徑、頰途徑或它們可以被吸入來遞送。

38、進(jìn)一步，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

39、在一些實(shí)施方案中，賦形劑包括藥學(xué)上可接受的溶劑、分散劑、附加劑、塑形劑等。通常，可將這些物質(zhì)配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的載體介質(zhì)中。配制好的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進(jìn)行給藥，其中包括但并不限于：瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、或局部給藥。在另一些實(shí)施方案中，藥物組合物是水性藥物組合物(例如，水溶液)，或者納米抗體與鹽在不含緩沖劑的水中提供，或者包含水性緩沖劑或其他類型溶劑(例如有機(jī)溶劑)。

40、本發(fā)明提供了如下任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，包括：

41、1)前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，前面所述的細(xì)胞，和/或前面所述的綴合物在制備檢測(cè)諾如病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

42、進(jìn)一步，所述諾如病毒包括諾如病毒1型。

43、進(jìn)一步，所述諾如病毒包括諾如病毒1型vp1蛋白。

44、進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括試劑盒、試紙、核酸膜條、芯片、系統(tǒng)、或裝置。

45、2)前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，前面所述的細(xì)胞，和/或前面所述的綴合物在制備預(yù)防或治療諾如病毒的藥物組合物中的應(yīng)用；

46、進(jìn)一步，所述諾如病毒包括諾如病毒1型。

47、進(jìn)一步，所述諾如病毒包括諾如病毒1型vp1蛋白。

48、本文所用的術(shù)語“治療”或“預(yù)防”指向個(gè)體進(jìn)行的任何類型的干預(yù)或處理，或?qū)χ黧w施用活性藥劑，旨在逆轉(zhuǎn)、減輕、改善、抑制、或減緩或防止與疾病相關(guān)的癥狀、并發(fā)癥、病況或生物化學(xué)指標(biāo)的進(jìn)展、發(fā)生、加重或復(fù)發(fā)。預(yù)防指向不患有疾病的主體施用，以防止疾病發(fā)生或如果發(fā)病將其影響降至最低。

49、3)前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，前面所述的細(xì)胞，和/或前面所述的綴合物在制備調(diào)節(jié)諾如病毒1型vp1蛋白活性或水平的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

50、進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括試劑盒、試紙、核酸膜條、芯片、系統(tǒng)、或裝置。

51、本發(fā)明提供了如下任一項(xiàng)的方法，包括：

52、1)一種生產(chǎn)前面所述的單克隆抗體的方法，所述方法包括：將前面所述的核酸分子或前面所述的載體轉(zhuǎn)化到細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞，或直接使用前面所述的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提純得到前面所述的單克隆抗體；

53、2)一種體外非治療目的抑制諾如病毒1型vp1蛋白活性或水平的方法，所述方法包括：將前面所述的單克隆抗體，前面所述的核酸分子，前面所述的載體，和/或前面所述的細(xì)胞使用到體外含有諾如病毒1型的細(xì)胞或組織中；

54、3)一種非診斷和非治療目的的檢測(cè)樣本諾如病毒的方法，所述方法包括將樣本與前面所述的單克隆抗體，和/或前面所述的綴合物接觸，檢測(cè)復(fù)合物的形成情況或標(biāo)記物的變化情況。

55、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

56、本發(fā)明提供了一種抗諾如病毒1型vp1蛋白的單克隆抗體，其親和力強(qiáng)，與諾如病毒1型vp1蛋白的結(jié)合活性高，是一種優(yōu)良的檢測(cè)和治療諾如病毒的單克隆抗體。