欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

一種提高CD8+T細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法及其應用

文檔序號:40554623發(fā)布日期:2025-01-03 11:14閱讀:12來源:國知局
一種提高CD8+T細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法及其應用

本發(fā)明涉及一種提高cd8+?t細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法及其應用,屬于動物細菌基因工程。


背景技術(shù):

1、由于操作方式簡便和成本低的優(yōu)勢,沙門菌載體疫苗相較于傳統(tǒng)疫苗顯示出良好的前景??诜庖吆?,沙門菌載體疫苗可以誘導黏膜表面的局部免疫反應,以防止病原體定殖或穿過黏膜表面引發(fā)感染。另一方面,沙門菌因其侵襲性,能夠進入宿主的腸道相關(guān)淋巴結(jié)組織,肝脾等內(nèi)臟器官,并在相應位置表達外源抗原,激發(fā)針對載體和外源抗原的特異性免疫,也一并賦予了沙門菌最大的誘發(fā)持久性免疫的潛力。但研究表明,沙門菌攜帶外源抗原蛋白時誘導的細胞免疫應答以cd4+?t細胞免疫應答為主,但卻僅能誘導有限的cd8+?t細胞免疫應答。

2、研究表明,細菌通過吞噬作用進入抗原呈遞細胞后,若能夠從吞噬體區(qū)室逃逸,直接進入細胞胞質(zhì)溶膠,載體遞送的蛋白質(zhì)就可被視為內(nèi)源性抗原,與mhc?i類分子結(jié)合后呈現(xiàn)在細胞表面,并產(chǎn)生強烈的cd8+?t細胞介導的免疫反應。相比之下,沙門菌傳遞的蛋白質(zhì)缺乏吞噬體逃逸機制,主要存在于含沙門菌的液泡(scvs)內(nèi),被視為外源性抗原并由mhcii類分子呈遞,主要誘導cd4+?t細胞免疫應答。胞內(nèi)存活方式不同解釋了沙門菌作為抗原遞送載體為何誘導了更高水平的cd4+?t細胞免疫應答,而破壞scvs的穩(wěn)定性,改變沙門菌在細胞內(nèi)的生存方式可能有助于外源抗原蛋白進入胞質(zhì),作為內(nèi)源性抗原蛋白經(jīng)由mhc?i類分子結(jié)合后呈現(xiàn)在細胞表面,并激活強烈的cd8+t細胞免疫反應。

3、t3ss-2效應蛋白,在scvs的穩(wěn)定性維持中發(fā)揮重要作用。而sted效應蛋白作為重要的t3ss-2效應蛋白之一,可以劫持參與細胞內(nèi)膜系統(tǒng)各個部分之間的物質(zhì)傳遞途徑,在維持scvs膜組分的穩(wěn)定性中可能發(fā)揮重要作用。但目前還沒有關(guān)于sted效應蛋白缺失后是否對scvs的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響的相關(guān)研究,也并未探究其缺失后對cd8+?t細胞免疫應答的影響。

4、cd8+?t細胞能夠通過mhc?i依賴性過程識別受感染的細胞,并分泌穿孔素和顆粒酶來裂解攜帶病原體的細胞。還可以通過cd8+?t細胞表達的死亡誘導配體與感染細胞表面的死亡受體結(jié)合來消除病原體感染的細胞??傊?,cd8+?t細胞免疫應答在清除急性感染、限制持續(xù)感染和賦予終身保護性免疫方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。細胞內(nèi)感染,特別是胞質(zhì)溶膠中的感染,更易通過抗原肽-mhc?i復合體激活cd8+?t細胞免疫應答。然而,部分感染吞噬細胞的微生物,由于胞質(zhì)溶膠中含量不高,無法有效形成微生物抗原肽-mhc?i復合體。因此,病原微生物的胞內(nèi)存活方式可影響免疫應答類型,足夠數(shù)量的病原進入胞質(zhì)溶膠在誘導高水平的cd8+?t細胞免疫應答中發(fā)揮重要作用。減毒沙門菌載體疫苗作為一種具有良好應用前景的新型疫苗,在誘導cd8+?t細胞方面的缺陷卻限制了它的使用。因此,提高細菌載體誘導的cd8+?t細胞免疫應答,可能為開發(fā)針對支原體、病毒或癌癥等疾病的疫苗提供新的思路和方向。


技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的:本發(fā)明的目的是提供了一種基于腸炎沙門菌sted效應蛋白的缺失,促使細菌攜帶的外源抗原蛋白從scvs進入胞質(zhì),進而經(jīng)由mhc?i類分子呈遞給cd8+?t細胞,誘導高水平的cd8+?t細胞免疫應答的方法。

2、技術(shù)方案:本發(fā)明提供了一種提高cd8+?t細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法,包括以下步驟:(1)將pkd46質(zhì)粒與腸炎沙門菌c50041混勻后電轉(zhuǎn),得到c50041(pkd46)菌株;

3、(2)用l-阿拉伯糖誘導培養(yǎng)c50041(pkd46)菌株,與含有aroc基因上下游同源臂的cat基因片段混合并進行電轉(zhuǎn)化,向其中轉(zhuǎn)入pcp20質(zhì)粒,誘導flp重組酶的表達,消除cat基因片段,得到rsc0152菌株;所述cat基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.1所示;

4、(3)將rsc0152菌株轉(zhuǎn)入pkd46質(zhì)粒,用l-阿拉伯糖誘導培養(yǎng)后電轉(zhuǎn)入含有sted基因上下游同源臂的cat基因片段,向其中轉(zhuǎn)入pcp20質(zhì)粒,消除cm抗性盒的打靶片段,得到rsc0156菌株,即為提高cd8+?t細胞免疫反應的腸炎沙門菌;所述cat基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

5、進一步地,步驟(2)中用于擴增所述的cat基因片段的引物序列如seq?id?no.3~4所示。

6、進一步地,步驟(3)中用于擴增所述的cat基因片段的引物序列如seq?id?no.5~6所示。

7、進一步地,擴增cat基因片段的pcr程序為98℃5min;94℃40sec,55℃15sec,72℃30sec,30cycles;72℃10min,4℃保存。

8、本發(fā)明還提供了通過上述構(gòu)建方法構(gòu)建得到的腸炎沙門菌在制備疫苗中的應用。

9、進一步地,所述疫苗用于誘導高水平的cd8+?t細胞免疫應答。

10、本發(fā)明還提供了一種預防和/或治療豬肺炎支原體感染的疫苗,所述疫苗通過以下步驟獲得:

11、(1)敲除rsc0156菌株中的asda基因片段,得到rsc0159菌株;所述asda基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.7所示;通過將rsc0156菌株和攜帶asda基因同源臂序列的cat基因打靶片段混合電轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)入pcp20質(zhì)粒消除cat基因片段獲得;(2)將rsc0159菌株轉(zhuǎn)入ps-p42質(zhì)粒,得到rsc0159(ps-p42)。

12、進一步地,步驟(1)中所述攜帶asda基因同源臂序列的cat基因打靶片段序列如seq?id?no.11所示。

13、進一步地,用于擴增所述的攜帶asda基因同源臂序列的cat基因打靶片段引物序列如seq?id?no.9~10所示。

14、進一步地,所述豬肺炎支原體感染由豬肺炎支原體強毒株f66引起。

15、有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明具有如下顯著優(yōu)點:本發(fā)明構(gòu)建的腸炎沙門菌通過向減毒的腸炎沙門菌rsc0152染色體中引入sted效應蛋白編碼基因缺失,改變細菌的胞內(nèi)存活方式,從scvs逃逸向胞質(zhì)的細菌數(shù)目增多,并誘導抗原呈遞細胞表面的mhc?i類分子水平,且顯著提高菌株誘導的cd8+?t細胞免疫反應;進一步引入asda基因缺失,構(gòu)建平衡致死系統(tǒng),遞送豬肺炎支原體mhp的熱休克p42蛋白后,同樣可誘導升高的抗原特異性免疫應答,特別是誘導了高水平的cd8+?t細胞免疫應答,并可在mhp菌株f66攻毒后改善小鼠體重,減輕鼻部癥狀和肺部病理組織變化。本發(fā)明為提高沙門菌載體疫苗誘導的的cd8+?t細胞免疫應答提供了一種新的策略,具有較大的市場應用潛力和潛在的經(jīng)濟效益。



技術(shù)特征:

1.一種提高cd8+t細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法,其特征在于,包括以下步驟:

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(2)中用于擴增所述的cat基因片段的引物序列如seq?id?no.3~4所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,步驟(3)中用于擴增所述的cat基因片段的引物序列如seq?id?no.5~6所示。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法,其特征在于,擴增cat基因片段的pcr程序為98℃5min;94℃40sec,55℃15sec,72℃30sec,30cycles;72℃10min,4℃保存。

5.權(quán)利要求1~3任一項所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的腸炎沙門菌在制備疫苗中的應用。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用,其特征在于,所述疫苗用于誘導高水平的cd8+t細胞免疫應答。

7.一種預防和/或治療豬肺炎支原體感染的疫苗,其特征在于,所述疫苗通過以下步驟獲得:

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預防和/或治療豬肺炎支原體感染的疫苗,其特征在于,步驟(1)中所述攜帶asda基因同源臂序列的cat基因打靶片段序列如seq?id?no.11所示。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的預防和/或治療豬肺炎支原體感染的疫苗,其特征在于,用于擴增所述的攜帶asda基因同源臂序列的cat基因打靶片段的引物序列如seq?id?no.9~10所示。

10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的預防和/或治療豬肺炎支原體感染的疫苗,其特征在于,所述豬肺炎支原體感染由豬肺炎支原體強毒株f66引起。


技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種提高CD8+T細胞免疫反應的腸炎沙門菌的構(gòu)建方法,所構(gòu)建的腸炎沙門菌通過向減毒的腸炎沙門菌rSC0152染色體中引入SteD效應蛋白編碼基因缺失,改變細菌的胞內(nèi)存活方式,從SCVs逃逸向胞質(zhì)的細菌數(shù)目增多,并誘導抗原呈遞細胞表面的MHC?I類分子水平,且顯著提高菌株誘導的CD8+T細胞免疫反應;進一步引入asdA基因缺失,構(gòu)建平衡致死系統(tǒng),遞送豬肺炎支原體Mhp的熱休克P42蛋白后,同樣可誘導升高的抗原特異性免疫應答,特別是誘導了高水平的CD8+T細胞免疫應答,并可在Mhp菌株F66攻毒后改善小鼠體重,減輕鼻部癥狀和肺部病理組織變化。本發(fā)明為提高沙門菌載體疫苗誘導的的CD8+T細胞免疫應答提供了一種新的策略,具有較大的市場應用潛力和潛在的經(jīng)濟效益。

技術(shù)研發(fā)人員:石火英,周國棟,馬琦豐,趙鈺瑩,侯新東,李權(quán)
受保護的技術(shù)使用者:揚州大學
技術(shù)研發(fā)日:
技術(shù)公布日:2025/1/2
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
喀什市| 郓城县| 苍梧县| 阳山县| 昔阳县| 大田县| 惠来县| 阿巴嘎旗| 沅江市| 鄂托克旗| 图片| 盐源县| 山东省| 双峰县| 崇信县| 双鸭山市| 精河县| 三门县| 安溪县| 桐柏县| 桂林市| 永登县| 宁晋县| 安庆市| 长沙县| 常宁市| 阳原县| 淅川县| 新宾| 治县。| 定日县| 桐梓县| 微山县| 蒙山县| 乐都县| 富锦市| 闽侯县| 元氏县| 拉萨市| 六枝特区| 普格县|