本發(fā)明涉及溶解的腺三磷雙磷酸酶多肽的設計和治療用途、藥物組合物、以及用于預防和治療組織損傷的方法。

背景技術：

1、腺三磷雙磷酸酶(atp-二磷酸酶、腺苷二磷酸酶、adp酶、或atp二磷酸水解酶)是質(zhì)膜結合的針對二磷酸核苷酸和三磷酸核苷酸(ndp和ntp)二者都具有活性的酶的酶組，并在兩個不同的連續(xù)磷酸鹽釋放步驟中以ndp為中間體將ntp水解成核苷酸一磷酸(nmp)。大多數(shù)在細胞表面發(fā)生并水解細胞外核苷酸的外部atp酶屬于該酶家族。它們與通過水解atp和adp二者來特異性水解atp的atp酶不同。

2、第一種已知的人腺三磷雙磷酸酶(外核苷三磷酸二磷酸水解酶-1(基因：entpd1，蛋白質(zhì)：ntpd酶1)，也稱為分化簇39(cd39，uniprot?p49961，或seq?id?no:1))是位于細胞表面的酶，具有面向細胞外的催化位點(extracellularly?facing?catalytic?site)。

3、在已知的人cd39家族中，成員cd39l3被稱為外部-腺三磷雙磷酸酶(外部-atpd酶)，其在cd39和cd39l1(外部-atp酶)之間具有生物化學活性。具體地，人cd39l3已被溶解并純化以用于治療目的，例如，如在us?7247300?b1(通過援引并入本文)中所披露的或作為seq?id?no:3包括在本文中。

技術實現(xiàn)思路

1、本披露尤其基于如下意想不到的發(fā)現(xiàn)：溶解的人腺三磷雙磷酸酶(如人cd39)的某些修飾導致具有驚人活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)仍然是安全且易于制造的。

2、根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其具有至少兩個修飾，這些修飾選自由以下組成的列表：n末端缺失、c末端缺失和中心修飾。

3、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含n末端缺失、c末端缺失和修飾缺失。

4、在一個實施例中，中心修飾包含一個或多個氨基酸的缺失。在另一個實施例中，中心修飾包含一個或多個氨基酸的點突變，如取代突變。在又另一個實施例中，中心修飾是一個或多個氨基酸的缺失和一個或多個氨基酸的點突變(如取代突變)的組合。

5、n末端缺失可以是從根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列的n末端缺失的30與50個氨基酸之間，如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個氨基酸的缺失。在優(yōu)選的實施例中，n末端缺失是34、37、38或45個氨基酸。

6、c末端缺失可以是從根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列的c末端缺失的20與40個氨基酸之間，如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個氨基酸的缺失。在優(yōu)選的實施例中，c末端缺失是22、29或37個氨基酸。

7、中心缺失可以是從根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列缺失的10與15個連續(xù)氨基酸之間，如10、11、12、13、14或15個氨基酸的缺失。在優(yōu)選的實施例中，中心缺失是12個氨基酸，如與根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列相關的氨基酸編號193至204。

8、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含與根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列相關的一個、兩個、三個、四個或五個點突變，這些突變選自由以下組成的組：k71e、n73q、v95a、g102d、y104s、t106s、r113m、l149m、v151a、e173d、t229a、l254m、k258r、w263r、e276d、n292q、r304g、i319t、n327q、a362n、f365s、n371q、k405n、y412f、l424q、h436d、i437n、f439s、g441d、n457q、p463s、和s469r。

9、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:32、seq?id?no:54、seq?id?no:56、seq?idno:70、seq?id?no:76、和seq?id?no:78。

10、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:131、seq?id?no:133、seq?id?no:135、seq?id?no:137、seq?id?no:139和seq?id?no:141。

11、在一個具體的實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:213、seq?id?no:227、seq?id?no:219、seq?id?no:227、seq?idno:217、seq?id?no:209、seq?id?no:221、seq?id?no:72、seq?id?no:215、seq?id?no:223、seq?id?no:211、seq?id?no:58和seq?id?no:229。

12、在一個具體的實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:213、seq?id?no:227、seq?id?no:219、seq?id?no:227、seq?idno:217、seq?id?no:209、seq?id?no:221、seq?id?no:72、seq?id?no:215、seq?id?no:223、seq?id?no:211、seq?id?no:58和seq?id?no:229。

13、在優(yōu)選的實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:58、seq?id?no:72和seq?id?no:229。

14、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:58。在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:72。在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:229。

15、在優(yōu)選的實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:58、seq?id?no:72和seq?id?no:229。

16、在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶由seq?id?no:58組成。在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶由seq?id?no:72組成。在一個實施例中，溶解的人腺三磷雙磷酸酶由seq?id?no:229組成。

17、根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明涉及包含治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明第一方面的腺三磷雙磷酸酶的藥物組合物，并提供了一種或多種藥學上可接受的運載體。

18、在一個實施例中，藥物組合物進一步包含一種或多種另外的活性成分。

19、根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了用作藥物的分離的根據(jù)第一方面的腺三磷雙磷酸酶。

20、根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了用于治療組織損傷的分離的根據(jù)第一方面的腺三磷雙磷酸酶。

21、組織損傷可以是急性腦損傷(中風)；急性多器官衰竭；腎臟或其他實體器官移植后移植物功能延遲；燒傷；輻射損傷；由于創(chuàng)傷和/或缺氧引起的急性損傷，如急性呼吸窘迫綜合征(ards)或肺損傷；急性腎損傷，如繼發(fā)于胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈旁路手術)或敗血癥或橫紋肌溶解癥或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷；急性心肌損傷。

22、在另一個實施例中，本披露的第四方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶，該腺三磷雙磷酸酶用于治療心臟手術相關的急性腎損傷。

23、在另一個實施例中，本披露的第四方面涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶，該腺三磷雙磷酸酶用于治療移植物功能延遲(dgf)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、急性心肌梗死(ami)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)/急性缺血性中風(ais)、缺血再灌注損傷(iri)、或通常被稱為多器官衰竭(mof)的其組合。

24、在一個實施例中，用于治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:58的氨基酸序列。

25、在一個實施例中，用于治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:72的氨基酸序列。在一個實施例中，用于治療心臟手術相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:229的氨基酸序列。

26、在另外的優(yōu)選實施例中，本披露涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶用于治療敗血癥相關的急性腎損傷的用途。

27、在第四方面的一個實施例中，用于治療敗血癥相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:58的氨基酸序列。

28、在第四方面的一個實施例中，用于治療敗血癥相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:72的氨基酸序列。

29、在第四方面的一個實施例中，用于治療敗血癥相關的急性腎損傷的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:229的氨基酸序列。

30、根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了治療人受試者中的組織損傷的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效劑量的根據(jù)第一方面的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。本發(fā)明第五方面的一個實施例涉及治療心臟手術相關的急性腎損傷的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶。

31、本發(fā)明第五方面的另一個實施例涉及治療移植物功能延遲(dgf)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、急性心肌梗死(ami)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)/急性缺血性中風(ais)、缺血再灌注損傷(iri)、或通常被稱為多器官衰竭(mof)的其組合的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的根據(jù)本發(fā)明第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶。

32、在第五方面的一個實施例中，用于治療心臟手術相關的急性腎損傷的方法中的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:58、seq?id?no:72或seq?id?no:229的氨基酸序列。

33、本發(fā)明第五方面的一個實施例涉及治療敗血癥相關的急性腎損傷的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的分離的根據(jù)本發(fā)明第一方面的腺三磷雙磷酸酶。

34、在第五方面的一個實施例中，用于治療敗血癥相關的急性腎損傷的方法中的溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含seq?id?no:58、seq?id?no:72或seq?id?no:229的氨基酸序列。組織損傷可以是急性腦損傷(中風)；急性多器官衰竭；腎臟或其他實體器官移植后移植物功能延遲；燒傷；輻射損傷；由于創(chuàng)傷和/或缺氧引起的急性損傷，如急性呼吸窘迫綜合征(ards)或肺損傷；急性腎損傷，如繼發(fā)于胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈旁路手術)或敗血癥或橫紋肌溶解癥或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷；急性心肌損傷。

35、根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了編碼根據(jù)第一方面的任何腺三磷雙磷酸酶的分離的核酸分子。

36、根據(jù)本發(fā)明的第七方面，提供了包含根據(jù)第六方面的一種或多種核酸序列的克隆載體或表達載體，其中該載體適用于根據(jù)第一方面的分離的腺三磷雙磷酸酶的重組產(chǎn)生。

37、根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了包含根據(jù)第七方面的一種或多種克隆載體或表達載體的宿主細胞。

38、根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了用于生產(chǎn)根據(jù)第一方面的腺三磷雙磷酸酶的方法，該方法包括培養(yǎng)根據(jù)第八方面的宿主細胞，純化和回收所述腺三磷雙磷酸酶。

39、根據(jù)本發(fā)明還公開了以下項的具體技術方案。

40、實施方案1.一種溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其具有至少兩個修飾，這些修飾選自由以下組成的列表：n末端缺失、c末端缺失和中心修飾。

41、實施方案2.如實施方案1所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，該溶解的人腺三磷雙磷酸酶具有n末端缺失、c末端缺失和中心修飾。

42、實施方案3.如實施方案1或2所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其中

43、a)該n末端缺失長度在30與50個氨基酸之間，

44、b)該c末端缺失長度在20與40個氨基酸之間，和

45、c)該中心修飾包含缺失和/或點突變。

46、實施方案4.如前述實施方案中任一項所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其中該中心修飾包含10至15個連續(xù)氨基酸的缺失。

47、實施方案5.如實施方案4所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其中該中心缺失是與根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列相關的氨基酸編號193至204的缺失。

48、實施方案6.如前述實施方案中任一項所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，其中該中心修飾包含點突變，該點突變包含與根據(jù)seq?id?no:1的野生型cd39序列相關的一個、兩個、三個、四個或五個點突變，所述點突變選自由以下組成的組：k71e、n73q、v95a、g102d、y104s、t106s、r113m、l149m、v151a、e173d、t229a、l254m、k258r、w263r、e276d、n292q、r304g、i319t、n327q、a362n、f365s、n371q、k405n、y412f、l424q、h436d、i437n、f439s、g441d、n457q、p463s、和s469r。

49、實施方案7.如前述實施方案中任一項所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:4、seq?id?no:6、seq?id?no:32、seq?id?no:54、seq?id?no:56、seq?id?no:70、seq?id?no:76、和seq?idno:78。

50、實施方案8.如前述實施方案中任一項所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:131、seq?idno:133、seq?id?no:135、seq?id?no:137、seq?id?no:139和seq?id?no:141。

51、實施方案9.如實施方案8所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，該溶解的人腺三磷雙磷酸酶包含如下序列或由如下序列組成，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:213、seqid?no:227、seq?id?no:219、seq?id?no:225、seq?id?no:217、seq?id?no:209、seq?id?no:221、seq?id?no:72、seq?id?no:215、seq?id?no:223、seq?id?no:211、seq?id?no:58和seqid?no:229。

52、實施方案10.如實施方案9所述的溶解的人腺三磷雙磷酸酶，該溶解的人腺三磷雙磷酸酶由如下序列組成，該序列選自由以下組成的組：seq?id?no:58、seq?id?no:72和seqid?no:229。

53、實施方案11.一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療有效劑量的如實施方案1至10中任一項所述的腺三磷雙磷酸酶、和一種或多種藥學上可接受的運載體。

54、實施方案12.如實施方案11所述的藥物組合物，該藥物組合物進一步包含一種或多種另外的活性成分。

55、實施方案13.一種分離的如實施方案1至10所述的腺三磷雙磷酸酶，該分離的腺三磷雙磷酸酶用作藥物。

56、實施方案14.一種分離的如實施方案1至10所述的腺三磷雙磷酸酶，該分離的腺三磷雙磷酸酶用于治療組織損傷。

57、實施方案15.用于根據(jù)實施方案14所述使用的分離的腺三磷雙磷酸酶，其中該組織損傷是急性腦損傷(中風)；急性多器官衰竭；腎臟或其他實體器官移植后移植物功能延遲；燒傷；輻射損傷；由于創(chuàng)傷和/或缺氧引起的急性損傷，如急性呼吸窘迫綜合征(ards)或肺損傷；急性腎損傷，如繼發(fā)于胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈旁路手術)或敗血癥或橫紋肌溶解癥或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷；急性心肌損傷。

58、實施方案16.一種分離的如實施方案1-10所述的腺三磷雙磷酸酶，該分離的腺三磷雙磷酸酶用于治療心臟手術相關的急性腎損傷。

59、實施方案17.一種分離的如實施方案1-10所述的腺三磷雙磷酸酶，該分離的腺三磷雙磷酸酶用于治療移植物功能延遲(dgf)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、急性心肌梗死(ami)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)/急性缺血性中風(ais)、缺血再灌注損傷(iri)、或通常被稱為多器官衰竭(mof)的其組合。

60、實施方案18.一種分離的如實施方案1-10所述的腺三磷雙磷酸酶，該分離的腺三磷雙磷酸酶用于治療敗血癥相關的急性腎損傷。

61、實施方案19.一種治療人受試者中的組織損傷的方法，該方法包括向所述受試者施用治療有效劑量的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。

62、實施方案20.如實施方案19所述的方法，其中該溶解的人腺三磷雙磷酸酶是如實施方案1至10所述的腺三磷雙磷酸酶。

63、實施方案21.如實施方案19或20所述的方法，其中該組織損傷是急性腦損傷(中風)；急性多器官衰竭；腎臟或其他實體器官移植后移植物功能延遲；燒傷；輻射損傷；由于創(chuàng)傷和/或缺氧引起的急性損傷，如急性呼吸窘迫綜合征(ards)或肺損傷；急性腎損傷，如繼發(fā)于胸外科手術(例如主動脈瓣置換術、冠狀動脈旁路手術)或敗血癥或橫紋肌溶解癥或抗生素或其他藥物的毒性作用的急性腎損傷；急性心肌損傷。

64、實施方案22.一種治療心臟手術相關的急性腎損傷的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。

65、實施方案23.一種治療移植物功能延遲(dgf)、急性呼吸窘迫綜合征(ards)、急性心肌梗死(ami)、創(chuàng)傷性腦損傷(tbi)/急性缺血性中風(ais)、缺血再灌注損傷(iri)、或通常被稱為多器官衰竭(mof)的其組合的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。

66、實施方案24.一種治療敗血癥相關的急性腎損傷的方法，該方法包括向需要這種治療的受試者施用治療有效劑量的溶解的人腺三磷雙磷酸酶。

67、實施方案25.一種分離的核酸分子，該分離的核酸分子編碼如實施方案1至10中所述的任何腺三磷雙磷酸酶。

68、實施方案26.一種克隆載體或表達載體，該克隆載體或表達載體包含一種或多種如實施方案25所述的核酸序列，其中該載體適用于分離的如實施方案1至10中所述的腺三磷雙磷酸酶的重組產(chǎn)生。

69、實施方案27.一種宿主細胞，該宿主細胞包含一種或多種如實施方案26所述的克隆載體或表達載體。

70、實施方案28.一種用于生產(chǎn)如實施方案1至10中任一項所述的腺三磷雙磷酸酶的方法，該方法包括培養(yǎng)如實施方案27所述的宿主細胞，純化和回收所述腺三磷雙磷酸酶。