本發(fā)明屬于肝癌藥物，涉及龍葵果實(shí)外泌體的提取方法及其在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、目前，靶向治療、介入治療和免疫治療是肝癌的主要治療手段，然而由于有效率低、副作用大及容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等問題，肝癌的臨床在治療依然面臨巨大的挑戰(zhàn)。

2、龍葵，也被稱為黑夜蕁麻或黑茄，是茄科植物的一種，廣泛分布于中國各地以及亞洲、歐洲、美洲等地。龍葵在治療腫瘤中有著悠久的應(yīng)用歷史，其地上部分包括莖、葉、花和果實(shí)均可入藥，尤其是以夏秋兩季采收的最為常用。龍葵味苦、甘，性寒，歸肝、胃、大腸經(jīng)，具有清熱解毒、利尿消腫、抗炎鎮(zhèn)痛、抗癌等多種藥理作用，常用于治療熱毒熾盛引起的多種疾病。現(xiàn)代藥理研究表明，龍葵中含有的多種化學(xué)成分，包括生物堿、皂苷、甾體化合物和黃酮類化合物等，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。

3、近年研究表明，來源于植物的外泌具有細(xì)胞毒性低、組織相容性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、跨物種調(diào)控等特性。然而，不同植物來源的外泌體具有高度的異質(zhì)性，生物學(xué)效應(yīng)不盡相同。

4、因此，積極尋找作用于肝癌的植物外泌體，通過提取并研究其有效作用成分，可以為植物來源外泌體治療肝癌提供理論依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中不同植物來源的外泌體具有高度的異質(zhì)性，生物學(xué)效應(yīng)不盡相同的問題，本發(fā)明提供了龍葵果實(shí)外泌體的提取方法及其在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，以解決肝癌現(xiàn)有治療手段有效率低、副作用大及容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等弊端。

2、本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、龍葵果實(shí)外泌體的提取方法，是一種采用差速離心法提取龍葵果實(shí)外泌體的方法，包括以下步驟：

4、1)將龍葵果實(shí)去梗，加入相當(dāng)于龍葵果實(shí)2倍質(zhì)量的pbs浸潤清洗30分鐘，再用去離子水清洗5次，每次10分鐘；

5、2)將清洗好的龍葵果實(shí)放入勻漿機(jī)中，運(yùn)行3-5分鐘，連續(xù)勻漿3次，經(jīng)200、300、450目濾網(wǎng)過濾雜質(zhì)后取上清液，分別設(shè)置離心機(jī)參數(shù)為1000g，10min；3000g，20min；10000g，40min進(jìn)行梯度離心，取上清液；

6、3)經(jīng)0.45um濾膜過濾后，設(shè)置離心機(jī)參數(shù)150000g，90min超高速離心取沉淀，用pbs重懸沉淀并充分渦旋后-80℃冰箱保存；

7、通過投射電鏡觀察提取的龍葵果實(shí)外泌體形態(tài)，采用納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(nta)對(duì)上步驟提取的做布朗運(yùn)動(dòng)的納米顆粒進(jìn)行追蹤分析，通過二維stokes-einstein方程計(jì)算顆粒流體力學(xué)半徑、代謝組學(xué)分析外泌體中成分：

8、電鏡下可以觀察到所提取的龍葵果實(shí)外泌體呈球形，為杯狀脂質(zhì)雙分子層膜微小囊泡，納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(nta)結(jié)果顯示其流體力學(xué)粒徑為160±10nm；

9、以代謝組學(xué)分析測定提取物的指紋圖譜和主要目標(biāo)藥效成分，并分析主要目標(biāo)成分溶出的變化，建立指紋圖譜，表明龍葵果實(shí)外泌體主要成分：

10、脂類和脂類分子28.14％；生物堿及其衍生物1.63％；苯環(huán)類化合物約為7.91％；木脂素、新木脂素及相關(guān)化合物2.56％；核苷、核苷酸和類似物3.26％；有機(jī)酸及衍生物15.81％；有機(jī)氮化合物2.09％；有機(jī)氧化合物10.47％；有機(jī)雜環(huán)化合物13.72％；烷醇類化合物及衍生物13.26％；其他1.16％。

11、本發(fā)明還涉及上述龍葵果實(shí)外泌體的提取方法得到的龍葵果實(shí)外泌體的應(yīng)用，是在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，具體是：①抑制肝癌細(xì)胞增殖；②抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

12、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

13、1、本發(fā)明所述的龍葵外泌體的提取方法，采用離心-蔗糖密度梯度超離心法能制備出穩(wěn)定性強(qiáng)、純度高的外泌體，與傳統(tǒng)離心法相比，能夠提高外泌體的生產(chǎn)質(zhì)量。

14、2、本發(fā)明所述的提取的龍葵果實(shí)外泌體應(yīng)用，體外能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，具有良好的治療效果。

15、3、本發(fā)明所述的龍葵果實(shí)外泌體的提取方法提取的龍葵果實(shí)外泌體相較于龍葵果實(shí)化學(xué)提取物，包含大量中藥水溶性差、易被人體快速清除和生物相容性差的代謝成分，藥用活性成分遠(yuǎn)高于龍葵果實(shí)化學(xué)提取物。龍葵果實(shí)外泌體脂質(zhì)雙分子層能有效地將活性成分或小分子rna穩(wěn)定傳遞到肝癌細(xì)胞中，具有低免疫原性、細(xì)胞攝取增強(qiáng)、表現(xiàn)出良好的生物相容性，更高的胃腸道穩(wěn)定性，并通過特殊內(nèi)吞機(jī)制以及能跨物種靶向特定組織，有效提高生物利用度，高效發(fā)揮抗癌作用。本發(fā)明所提取的龍葵外泌體與肝癌細(xì)胞兼容性好，可以作為藥物遞載系統(tǒng)，從而提高肝癌療效。

技術(shù)特征：

1.龍葵果實(shí)外泌體的提取方法，其特征在于：是一種采用差速離心法提取龍葵果實(shí)外泌體的方法，包括以下步驟：

2.權(quán)利要求1所述的龍葵果實(shí)外泌體的提取方法得到的龍葵果實(shí)外泌體的應(yīng)用，其特征在于：是在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用。

3.權(quán)利要求2所述的龍葵果實(shí)外泌體的應(yīng)用，其特征在于：是龍葵果實(shí)外泌體制備以下治療肝癌藥物中的應(yīng)用：①抑制肝癌細(xì)胞增殖；②抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了龍葵果實(shí)外泌體的提取方法及其在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明采用差速離心法提取龍葵果實(shí)外泌體并對(duì)外泌體進(jìn)行鑒定，以解決肝癌現(xiàn)有治療手段有效率低、副作用大及容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等弊端。本發(fā)明還涉及上述龍葵果實(shí)外泌體的提取方法得到的龍葵果實(shí)外泌體的應(yīng)用，是在制備治療肝癌藥物中的應(yīng)用，具體是：①抑制肝癌細(xì)胞增殖；②抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

技術(shù)研發(fā)人員：曾普華,張振,梁子成,譚小寧,方霞溢
受保護(hù)的技術(shù)使用者：湖南省中醫(yī)藥研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23